熊 鳴，張達(dá)矜，喬媛媛，史成和

體溫過(guò)低癥是一種嚴(yán)重的臨床綜合征,中重度體溫過(guò)低癥的死亡率極高,病死率甚至高于心肌梗死和感染性休克,但其救治困難的機(jī)制尚不十分清楚[1]。低溫是體溫過(guò)低癥最根本的致傷因素。多項(xiàng)動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)低溫可直接誘導(dǎo)組織損傷和細(xì)胞死亡。已有研究提示,腸上皮細(xì)胞功能、結(jié)構(gòu)受損在低溫臟器損害的發(fā)生發(fā)展中可能具有極其重要的作用[2]。本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上,通過(guò)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化低溫應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠小腸隱窩上皮(intestinal epithelial crypt,IEC-6)細(xì)胞損傷條件,建立較為穩(wěn)定的低溫應(yīng)激細(xì)胞損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?為后續(xù)的低溫應(yīng)激損傷與繼發(fā)性損傷機(jī)制以及救治研究奠定細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠IEC-6細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心提供。高糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)試劑(cell counting kit-8,CCK-8)為日本同仁化學(xué)研究所產(chǎn)品；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑AnnexinⅤ-PE/7-AAD Kit和線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑JC-1 Kit為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天傳代1次。

1.2.2 細(xì)胞低溫處理方法 將生長(zhǎng)良好的IEC-6細(xì)胞置于密閉細(xì)胞培養(yǎng)小室(billups-rothenberg產(chǎn)品,MIC-101型),設(shè)定通氣條件為95%空氣+5%CO2預(yù)混合氣體,以20 L/min流量持續(xù)通氣8 min,置于設(shè)定溫度條件有機(jī)箱中。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在50%＜細(xì)胞存活率＜90%范圍內(nèi)采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化處理?xiàng)l件。以溫度、處理時(shí)間和接種密度為正交優(yōu)化的3個(gè)因素,每個(gè)因素設(shè)定3個(gè)水平,分別為處理溫度(4℃,10℃,22℃),低溫處理時(shí)間(2 h,4 h,6 h),接種密度(1×105/mL,2.5×105/mL,5×105/mL),根據(jù)三因素三水平設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)表,得到9個(gè)實(shí)驗(yàn)組,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。CCK-8法分析細(xì)胞毒性,在50%＜細(xì)胞存活率＜90%范圍內(nèi)獲得最優(yōu)組合條件。隨后,實(shí)驗(yàn)組IEC-6細(xì)胞以最優(yōu)組合條件進(jìn)行處理,同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組,鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和線(xiàn)粒體膜電位。

1.2.4 CCK-8法分析細(xì)胞毒性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期IEC-6細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度,接種于96孔板中(每孔100 μL),于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h后更換培養(yǎng)基。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組,實(shí)驗(yàn)組置于細(xì)胞培養(yǎng)小室(通氣條件為95%空氣+5%CO2),分別于設(shè)定低溫(4℃,10℃,22℃)環(huán)境條件下培養(yǎng)設(shè)定處理時(shí)間(2 h,4 h,6 h)。正常對(duì)照組置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱正常培養(yǎng),同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。處理結(jié)束后加入CCK-8試劑,37℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h,酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm吸光度(A)。按公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)＝[(A實(shí)驗(yàn)孔-A空白孔)/(A對(duì)照孔-A空白孔)]×100%。(1-細(xì)胞存活率)即代表細(xì)胞毒性。1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和線(xiàn)粒體膜電位取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期IEC-6細(xì)胞,按最優(yōu)組合條件調(diào)整細(xì)胞密度,接種于10 cm2培養(yǎng)皿中(每皿3 mL),于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h后更換培養(yǎng)基。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組,實(shí)驗(yàn)組置于細(xì)胞培養(yǎng)小室(通氣條件為95%空氣+5%CO2),于設(shè)定溫度環(huán)境條件下培養(yǎng)設(shè)定處理時(shí)間,正常對(duì)照組置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)。

收集各組細(xì)胞和培養(yǎng)上清,調(diào)整密度至5×105/mL,分別進(jìn)行如下處理：①按照AnnexinⅤ-PE/7-AAD Kit說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。流程簡(jiǎn)述如下：取上述細(xì)胞懸液1 mL,400 g離心5 min,去上清液,4℃預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次,加入0.5 mL結(jié)合緩沖液重懸,加入5 μL AnnexinⅤ-PE抗體,輕輕混勻,室溫避光孵育15 min后,加入5 μL7-AAD,輕輕混勻后上機(jī)檢測(cè)。②按照J(rèn)C-1 Kit說(shuō)明書(shū)檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位。流程簡(jiǎn)述如下：取上述細(xì)胞懸液1 mL,400 g離心5 min,去上清液,加入0.5 mL新鮮配置的JC-1工作液,輕輕混勻,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育15 min,加入1×分析緩沖液洗滌2次,加入0.5 mL 1×分析緩沖液重懸,輕輕混勻后上機(jī)檢測(cè)。當(dāng)細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位正常時(shí),JC-1主要以聚合體形式存在,FL-2通道上顯示為高強(qiáng)度紅色熒光信號(hào)；當(dāng)膜電位發(fā)生去極化時(shí),JC-1則主要以單體形式存在,FL-2通道上紅色熒光信號(hào)減弱,細(xì)胞群發(fā)生偏移。通過(guò)CellQuest軟件分析強(qiáng)弱紅色熒光信號(hào)細(xì)胞比例,相對(duì)定量線(xiàn)粒體膜電位水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件和正交設(shè)計(jì)助手ⅡV3.1專(zhuān)業(yè)版軟件,設(shè)計(jì)三因素三水平正交表,通過(guò)極差法確定主效應(yīng)因素。應(yīng)用CellQuest軟件分析流式細(xì)胞結(jié)果,數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化低溫應(yīng)激誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞損傷的條件,按三因素三水平設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(表1)。根據(jù)R值大小可知,在50%＜細(xì)胞存活率＜90%范圍內(nèi),3個(gè)因素對(duì)細(xì)胞毒性的影響程度為：處理溫度＞低溫處理時(shí)間＞接種密度。通過(guò)K值分析上述范圍內(nèi)3個(gè)因素各水平對(duì)細(xì)胞毒性的影響程度為：處理溫度：4℃＞10℃＞22 ℃,接種密度：5×105/mL＞1×105/mL＞2.5×105/mL,低溫處理時(shí)間：4 h＞6 h＞2 h。 因此在50%＜細(xì)胞存活率＜90%范圍內(nèi),低溫應(yīng)激誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞損傷的最優(yōu)組合條件為：處理溫度4℃,接種密度5×105/mL,低溫處理時(shí)間4 h。

表1 三因素三水平設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)表正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 最優(yōu)組合條件下IEC-6細(xì)胞形態(tài) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期IEC-6細(xì)胞以5×105/mL密度接種于10 cm2培養(yǎng)皿中(每皿3 mL),正常培養(yǎng)條件下孵育12 h后更換培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞置于4℃處理4 h,鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。結(jié)果如圖1所示：正常IEC-6細(xì)胞為不規(guī)則多角形,邊界清楚,細(xì)胞核較大,呈卵圓形,細(xì)胞間相互連接,呈鋪路石鑲嵌排列,互不重疊。而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胞體收縮變小,邊緣模糊呈扁平狀,胞漿內(nèi)可見(jiàn)黑色顆粒狀物,折光性降低,細(xì)胞核大小不一,形態(tài)不規(guī)則。

圖1 鏡下細(xì)胞形態(tài)

2.3 最優(yōu)組合條件下IEC-6細(xì)胞凋亡和線(xiàn)粒體膜電位 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞置于4℃處理4 h后,細(xì)胞凋亡情況如圖2A所示：與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡明顯加重。前者以早期凋亡為主,細(xì)胞凋亡率為(4.41±1.36)%,后者則以中晚期凋亡和壞死為主,細(xì)胞凋亡率為(23.70±2.94)%,2者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F＝14.56,P＜0.01)。

線(xiàn)粒體膜電位變化如圖2B所示：與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞群發(fā)生明顯偏移,表現(xiàn)為FL-2通道紅色熒光信號(hào)減弱,低強(qiáng)度紅色熒光細(xì)胞(R2)比例顯著增高,(31.12±3.66)%vs(5.24±0.57)%(F＝23.80,P＜0.01)。說(shuō)明線(xiàn)粒體膜電位去極化增強(qiáng),與之伴隨的細(xì)胞凋亡亦加重,結(jié)果與前者一致。

圖2 細(xì)胞凋亡和線(xiàn)粒體膜電位

3 討論

體溫過(guò)低癥是指各種原因引起的中心體溫低于35℃時(shí)的狀態(tài)[3]。研究表明,體溫過(guò)低癥能引起機(jī)體多個(gè)生理系統(tǒng)功能失調(diào),包括微循環(huán)改變和組織氧供減少,最終導(dǎo)致以嚴(yán)重休克、水電解質(zhì)紊亂和凝血障礙為突出表現(xiàn)的多器官功能障礙綜合征(multiorgan dysfunction syndrome,MODS)[4-5]。隨著社會(huì)的發(fā)展,潛水、航海、高寒地區(qū)作業(yè)及登山等活動(dòng)相應(yīng)增加,體溫過(guò)低癥發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)。然而,目前對(duì)于體溫過(guò)低癥病理過(guò)程中,導(dǎo)致組織和細(xì)胞損傷的機(jī)制尚不清楚,因此缺乏特殊有效的臨床救治措施,這也是中重度體溫過(guò)低癥患者高死亡率的重要原因[6-7]。

低溫是體溫過(guò)低癥最根本的致傷因素。多項(xiàng)動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)低溫可直接誘導(dǎo)組織損傷和細(xì)胞死亡。根據(jù)低溫程度不同,細(xì)胞可激活凋亡信號(hào)或直接壞死。低溫引起的凍結(jié)性損傷主要通過(guò)生物膜結(jié)構(gòu)和形態(tài)異常、膜的生理功能紊亂等導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂,細(xì)胞崩解壞死；而在非凍結(jié)性損傷時(shí),主要通過(guò)激活細(xì)胞凋亡信號(hào),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8-9]。在各種原因引起MODS的發(fā)生中,腸道既是受損的“靶”器官,又是損傷的“激發(fā)”器官[10-11]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)腸上皮細(xì)胞功能、結(jié)構(gòu)受損在低溫臟器損害的發(fā)生發(fā)展中具有極其重要的作用,是導(dǎo)致重度體溫過(guò)低癥MODS的重要原因[12-13]。然而,目前對(duì)于腸上皮細(xì)胞凋亡在體溫過(guò)低癥病理生理過(guò)程中的的具體作用,針對(duì)低溫尤其低溫引起的繼發(fā)性損傷的機(jī)制尚不清楚[14-15]。本研究以大鼠IEC-6細(xì)胞為研究對(duì)象,采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化低溫應(yīng)激誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞損傷的條件,建立較為穩(wěn)定的腸上皮細(xì)胞低溫應(yīng)激損傷模型,為后續(xù)的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是利用正交表科學(xué)的安排與分析多因素實(shí)驗(yàn)的方法,是科研中當(dāng)需要考慮多因素、多水平對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響時(shí)優(yōu)先選用的實(shí)驗(yàn)分析方法；具有高效、快速、靈活、均勻分散及整齊可比的特點(diǎn)；通過(guò)極差R值來(lái)反應(yīng)各優(yōu)化因素對(duì)結(jié)果影響的程度,極差R值越大,影響程度越大。為后續(xù)進(jìn)一步干預(yù)處理,本研究將細(xì)胞損傷程度設(shè)定在50%＜細(xì)胞存活率＜90%范圍內(nèi),通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得該范圍內(nèi)低溫應(yīng)激誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞損傷的最優(yōu)組合條件為：處理溫度4℃,接種密度5×105/mL,低溫處理時(shí)間4 h。進(jìn)一步評(píng)價(jià)最優(yōu)組合條件下IEC-6細(xì)胞損傷情況：光學(xué)顯微鏡顯示細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞凋亡率和線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)相結(jié)合顯示細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明：與對(duì)照組相比,最優(yōu)組合條件下實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞失去正常形態(tài),同時(shí)線(xiàn)粒體膜電位去極化增強(qiáng),細(xì)胞凋亡顯著加重。符合低溫應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞損傷特點(diǎn),為后續(xù)低溫致傷機(jī)制研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。