王琪，王蘭，馬文麗

山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006

金屬硫蛋白（metallothionein，MT）廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)，是富含半胱氨酸的小分子金屬結(jié)合蛋白，結(jié)構(gòu)保守，對(duì)多種金屬有高度親和性[1-2]。多個(gè)研究表明，MT能特異地與鋅、銅、鎘等重金屬結(jié)合，在解除重金屬毒性方面起重要作用[3-4]，并且發(fā)現(xiàn)MT可以清除體內(nèi)自由基，具有延緩衰老、抗腫瘤等重要功能[5-6]，所以金屬硫蛋白具有重大研究?jī)r(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

河南華溪蟹（Sinopotamon honanense）由海洋蟹多元轉(zhuǎn)化而來(lái)，廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江及黃河流域淡水水體基底層，直接面對(duì)沉積在水體內(nèi)的重金屬離子，其組織中的MT含量可以作為一種監(jiān)測(cè)水體重金屬暴露的生物標(biāo)志物。在前期研究中，我們從河南華溪蟹中分離純化了MT并克隆了其cDNA全長(zhǎng)序列，進(jìn)一步研究了不同金屬脅迫下MT的組織細(xì)胞定位[7-8]。本研究旨在選擇合適的表達(dá)載體，獲得MT的體外穩(wěn)定表達(dá)，為MT的規(guī)模化制備奠定基礎(chǔ)。

His-tag（由6～10個(gè)組氨酸殘基組成）和GST-tag（谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）是目前原核表達(dá)系統(tǒng)中最常見的2種融合蛋白標(biāo)簽。已有研究者通過(guò)融合6×His標(biāo)簽制備重組MT，但因?yàn)镸T相對(duì)分子質(zhì)量?jī)H為6000～7000，而His-tag的相對(duì)分子質(zhì)量也很小，以致重組后的6×His-MT蛋白分子太小，在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)不穩(wěn)定，誘導(dǎo)產(chǎn)物往往為無(wú)功能蛋白[9-10]。與6×His-tag相比，GST-tag相對(duì)分子質(zhì)量較大，約為26 000，可提高目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性，適用范圍廣，能在不同的宿主中表達(dá)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇GST-tag作為融合蛋白標(biāo)簽，采用基因克隆方法構(gòu)建pGEX-6p-1-MT重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白GSTMT。通過(guò)火焰原子分光光度法進(jìn)一步研究了重組菌體對(duì)重金屬的生物吸附能力，旨在為重金屬污染治理提供新的方法及手段。

1 材料與方法

1.1 MT全長(zhǎng)編碼區(qū)基因的擴(kuò)增

根據(jù)MT cDNA序列及表達(dá)載體pGEX-6p-1的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)帶有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的引物。上游引物為5′-CGGGATCCATGCCTG ATCCTTGC-3′，下劃線序列為BamHⅠ酶切位點(diǎn)，ATG是起始密碼子，CG為保護(hù)堿基；下游引物為5′-CCCTCGAGTTATCAGGGGCAGCAG-3′，下 劃 線序列為XhoⅠ酶切位點(diǎn)，TTATCA是2個(gè)終止密碼子，CC為保護(hù)堿基。以MT cDNA序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃ 3 min；變性94℃ 30 s，退火 50℃ 30 s，延伸 72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；延伸72℃ 10 min），PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用膠回收試劑盒回收。

1.2 pMD19-T-MT載體克隆

將回收的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體（購(gòu)自TaKaRa公司）連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，擴(kuò)大培養(yǎng)白色單克隆并提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和XhoⅠ酶切提取的質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.3 pGEX-6p-1-MT表達(dá)載體的構(gòu)建

BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pMD19-T-MT載體和pGEX-6p-1表達(dá)載體（本實(shí)驗(yàn)室保存），凝膠電泳檢測(cè)，膠回收酶切產(chǎn)物；用T4DNA連接酶將MT基因連接到pGEX-6p-1上，獲得重組質(zhì)粒；將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，在含氨芐西林（Amp，50 mg/L）的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)菌液PCR檢測(cè)，提取質(zhì)粒交生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 GST-MT融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將測(cè)序正確的pGEX-6p-1-MT重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3），37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)16 h后，按1∶100接種到含Amp（50 mg/L）的新鮮培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，待菌液D600nm≥0.6時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG溶液誘導(dǎo)6 h，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，PBS重懸菌體，加入PMSF蛋白酶抑制劑超聲波破碎，1 h后16 000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析鑒定。

1.5 轉(zhuǎn)MT工程菌對(duì)重金屬的生物吸附能力檢測(cè)

將表達(dá)菌體與對(duì)照菌株（僅含空載體pGEX-6p-1）按1∶100接種至50 mL新鮮培養(yǎng)基（含50 mg/L Amp）中擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌液D600nm≥0.6時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，同時(shí)分別加入300 μmol/L的ZnSO4、CdCl2和 CuSO4溶液，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)6 h，4℃、12 000 r/min離心10 min收集菌體，用新鮮的LB洗滌2次，80℃處理48 h后稱量菌體干重并用超純水重懸、定容。利用火焰原子分光光度計(jì)分別測(cè)定轉(zhuǎn)MT工程菌及對(duì)照菌體對(duì)Zn2+（213.9 nm）、Cu2+（324.8 nm）和Cd2+（228.8 nm）的生物吸附，以菌體干重（DW，μmol/g）表示。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)平行做3次，結(jié)果以x±s表示。用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析進(jìn)行工程菌和對(duì)照菌株的差異顯著性分析。

圖1 PCR擴(kuò)增河南華溪蟹MT基因瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 pMD19-T-MT和pGEX-6p-1的雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 融合蛋白GST-MT表達(dá)的SDS-PAGE分析

圖4 轉(zhuǎn)MT工程菌對(duì)重金屬的生物吸附

2 結(jié)果

2.1 MT全長(zhǎng)編碼區(qū)基因的擴(kuò)增

以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的pET-28a-MT為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的目的片段條帶清晰，大小約為190 bp，符合MT基因的理論值（圖1）。

2.2 pMD19-T-MT與表達(dá)載體pGEX-6p-1的雙酶切

將目的片段膠回收連接到pMD19-T質(zhì)粒上，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落擴(kuò)增，提取質(zhì)粒pMD19-T-MT。用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切pMD19-T-MT和pGEX-6p-1載體，凝膠電泳檢測(cè)條帶明顯且符合理論值（圖2）。膠回收酶切產(chǎn)物。

2.3 重組表達(dá)載體pGEX-6p-1-MT的鑒定

將雙酶切的目的片段與表達(dá)載體連接，構(gòu)建重組載體pGEX-6p-1-MT，菌液PCR檢測(cè)并送生工生物公司測(cè)序（序列略），測(cè)序結(jié)果表明目的片段正確，無(wú)突變，證明重組載體pGEX-6p-1-MT構(gòu)建成功。

2.4 融合蛋白GST-MT的誘導(dǎo)表達(dá)

取超聲波破碎后的菌體上清液，SDS-PAGE分析融合蛋白GST-MT的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3。目標(biāo)蛋白獲得可溶性表達(dá)，相對(duì)分子質(zhì)量約為33 000，與預(yù)期一致（GST的相對(duì)分子質(zhì)量約為26 000，MT的相對(duì)分子質(zhì)量為6000～7000）。

2.5 轉(zhuǎn)MT工程菌重金屬生物吸附能力檢測(cè)

用火焰原子分光光度計(jì)分別測(cè)定工程菌對(duì)Zn2+、Cu2+和Cd2+的吸附能力，結(jié)果見圖4?？站w和工程菌吸附Zn2+的能力分別為0.22、0.808 μmol/g，單因素方差分析表明工程菌的吸附能力極顯著高于空菌體（P＜0.01）?？站w和工程菌吸附 Cd2+的能力分別為 0.618、1.34 μmol/g，方差分析顯示工程菌的生物吸附能力極顯著增加（P＜0.01）?？站w和工程菌吸附Cu2+的能力分別為0.206、0.528 μmol/g，方差分析得知工程菌的生物吸附能力極顯著高于空菌體（P＜0.01）。3種重金屬中，工程菌對(duì)Cd2+的吸附能力最強(qiáng)，其次是Zn2+和Cu2+，可能源于我們最初從河南華溪蟹中克隆得到的為鎘誘導(dǎo)的MT cDNA。

3 討論

MT分子很小，且富含半胱氨酸，半衰期短，在大腸桿菌體內(nèi)不穩(wěn)定，極易形成無(wú)生物活性的包涵體。并且因其具有很強(qiáng)的金屬結(jié)合特性，易螯合體內(nèi)必需金屬元素而對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生較大的毒性，因此金屬硫蛋白的原核表達(dá)一直是個(gè)難題[11-12]。我們?cè)谇捌谘芯恐校瑢⒑幽先A溪蟹MT基因克隆至常規(guī)表達(dá)載體pET-28a及pQE31上，發(fā)現(xiàn)其可溶性表達(dá)極低，絕大部分以包涵體形式存在。另外，pET-28a及pQE31攜帶的6×His-tag雖能穩(wěn)定地與配體特異性結(jié)合，但重組蛋白純化須通過(guò)鎳柱，而鎳柱中的氯化鎳含有二價(jià)金屬離子，可能會(huì)與MT結(jié)合，影響下一步咪唑洗脫重組。而pGEX-6p-1載體表達(dá)的外源蛋白與谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶融合表達(dá)，通過(guò)GST親和層析進(jìn)行純化，特異性高，純化方便且溫和[13]。重要的是GST-MT重組蛋白在純化時(shí)可以避免與柱填料結(jié)合，能以最優(yōu)條件獲得穩(wěn)定的GST-MT融合蛋白。因此，我們最終選擇pGEX-6p-1表達(dá)載體，獲得了GST-MT的可溶性融合表達(dá)，為后續(xù)MT的規(guī)?；苽涞於嘶A(chǔ)。

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，各種污染物大量排放，使得環(huán)境污染日趨嚴(yán)重，對(duì)人和動(dòng)物的安全造成一定影響。減少環(huán)境污染、遏制生態(tài)環(huán)境的惡化成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。生物修復(fù)技術(shù)因其成本低、效果好、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)受到普遍關(guān)注，成為環(huán)境治理的主要方法和技術(shù)[14]，其中利用基因工程菌解決環(huán)境中的石油、農(nóng)藥、表面活性劑及重金屬污染問(wèn)題已成為環(huán)境污染修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[15]。近年來(lái)也有報(bào)道表明金屬硫蛋白因其具有高的金屬結(jié)合能力，在環(huán)境污染修復(fù)領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價(jià)值[16-17]。本研究探討了轉(zhuǎn)MT工程菌對(duì)重金屬的生物吸附作用，結(jié)果顯示工程菌對(duì)Zn2+、Cd2+及Cu2+的生物吸附能力分別為對(duì)照菌株的3.62、2.17及2.56倍，均呈極顯著差異。在3種重金屬中，轉(zhuǎn)MT工程菌對(duì)Cd2+的吸附能力最強(qiáng)，推測(cè)與我們最初克隆的為鎘誘導(dǎo)華溪蟹MT cDNA有關(guān)。由于金屬溶液濃度過(guò)高會(huì)脅迫菌體，使菌種快速死亡，所以在進(jìn)行轉(zhuǎn)MT工程菌吸附重金屬實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要注意配制的金屬溶液的濃度。綜合各種因素，實(shí)驗(yàn)最終選擇使用的金屬離子溶液濃度為300 μmol/L。

綜上所述，我們實(shí)現(xiàn)了河南華溪蟹MT的GST融合表達(dá)，為利用基因工程技術(shù)大規(guī)模制備MT奠定了基礎(chǔ)；同時(shí)轉(zhuǎn)MT工程菌顯著增強(qiáng)了吸附重金屬的能力，為重金屬污染修復(fù)提供了新的技術(shù)手段。