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        慢性腎病并發(fā)慢性心血管損傷大鼠模型的建立

        2018-10-23 11:27:36姚波馬曉燕張魯囡王禹
        生物技術(shù)通訊 2018年5期
        關(guān)鍵詞:別嘌呤醇腺嘌呤肌酐

        姚波,馬曉燕,張魯囡,王禹

        1.解放軍總醫(yī)院,北京 100853;2.長春中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院,吉林 長春 130021;3.北京衛(wèi)戍區(qū) 海淀第三退休干部休養(yǎng)所,北京 100853

        慢性腎臟疾?。╟hronic kidney disease,CKD)是威脅人類健康的重要疾病,全世界有超過200萬人患有終末期腎臟病[1-2],需要依賴腎臟替代治療維持生命。大鼠CKD模型可促進人們對CKD發(fā)生機制的理解,并用于測試新藥。在大鼠飼料中添加腺嘌呤可誘導(dǎo)形成大鼠CKD模型。飼料中添加質(zhì)量分數(shù)0.75% 的腺嘌呤便可導(dǎo)致腎臟損傷,具體表現(xiàn)為腎臟體積增大、結(jié)節(jié)樣外觀、凋亡性病損、70% ~80% 的腎臟組織纖維化、血漿尿素氮和血清肌酐升高、電解質(zhì)代謝紊亂[3]和氧化應(yīng)激。與人類CKD以年計的進展進度不同,大鼠CKD模型的這些改變均可在4周內(nèi)出現(xiàn)。

        作為一種嘌呤堿基,腺嘌呤是黃嘌呤氧化酶的產(chǎn)物,是體內(nèi)尿酸的潛在來源之一[4]。尿酸是誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、CKD、高血壓、心肌肥大和炎癥的重要因素[5],能夠?qū)е滦呐K和腎臟損傷,在某些情況下還能導(dǎo)致終末期腎臟病[6]。本次研究的主要目的是明確腺嘌呤誘導(dǎo)CKD模型的腎臟和心臟結(jié)構(gòu)及功能改變的特征,其次要明確應(yīng)用別嘌呤醇降低尿酸濃度能否減輕大鼠對腺嘌呤的反應(yīng)。經(jīng)過劑量實驗、腎臟和心臟結(jié)構(gòu)分析及功能學(xué)實驗,我們認為,應(yīng)用質(zhì)量分數(shù)為0.25% 的腺嘌呤誘導(dǎo)16周,能夠引發(fā)高尿酸誘導(dǎo)性的慢性腎臟損傷,這可能作為一種用于模擬人類CKD且伴有心血管并發(fā)癥的動物模型。

        1 材料和方法

        1.1 動物實驗

        動物實驗流程和方法均通過解放軍總醫(yī)院動物福利委員會的審核。9~10周齡雄性Wistar大鼠(n=76,體重333±1 g)購自維通利華公司,分為7個實驗組,處理16周。第1組(對照組,n=12)飲食為大鼠粉末食料(維通利華公司);第2~5組,向粉末食料中添加腺嘌呤(Carbosynth公司),使腺嘌呤質(zhì)量分數(shù)分別為0.075% (n=10)、0.25% (n=12)、0.5% (n=10)或 0.75% (n=8);第 6組給予0.25% 腺嘌呤16周,同時給予25 mg/(kg·d)別嘌呤醇(Sigma公司)(n=12);第7組從第8~16周單獨給予25 mg/(kg·d)別嘌呤醇(n=12)。

        1.2 收縮壓的測量

        每4周測量1次大鼠的收縮壓,測量前靜脈注射給予Zoletil(替來他明15 mg/kg,唑拉西泮15 mg/kg)使動物輕度鎮(zhèn)靜。用MLT1010 Piezo-Electric Pulse Tranducer(ADInstrucments公司)及不可充氣的尾鉗(tail-cuff)與 MLT884 Physiologi?cal Pressure Transducer及Power Lab數(shù)據(jù)獲取單元(ADInstruments公司)測量并獲取數(shù)據(jù)[7]。

        1.3 腎功能評估

        16周飼喂結(jié)束后,將大鼠于代謝籠中飼養(yǎng)24 h,收集尿液用于蛋白、肌酐和尿素氮濃度的測量。收集尿液后,麻醉大鼠并收集血漿標(biāo)本。測量血漿尿素氮、肌酐、尿酸、鈉、鉀、鈣、乳酸脫氫酶、總膽固醇、總甘油三酯及非酯化脂肪酸。計算肌酐清除率。

        1.4 獲取離體的心臟

        獲取血液標(biāo)本后剪下大鼠的心臟,于0℃結(jié)晶灌注液中保存。在殘主動脈冠狀動脈口上方向主動脈內(nèi)置入套管,進行心臟灌注,通過在左心室內(nèi)置入乳膠球囊導(dǎo)管評估等容心室功能;導(dǎo)管與Capto SP844MLT844 Physiological Pressure Transducer and Chart軟件相連,用MacLab System和PowerLab數(shù)據(jù)獲取單元(ADInstruments公司)測量獲得數(shù)據(jù)。實驗結(jié)束后,解剖去除心房和右心室,留下左心室和室間隔,用紗布吸干,稱重。心肌舒張的順應(yīng)性通過舒張順應(yīng)性常數(shù)κ計算。

        1.5 血管反應(yīng)的器官浸浴實驗

        胸主動脈弓(長度4 mm)置于器官浸浴小室,靜息張力為10 mN。測量去甲腎上腺素的累積濃度反應(yīng)(收縮)曲線;在對去甲腎上腺素次峰值(~70% )收縮存在的同時,測量乙酰膽堿和硝普納的濃度-反應(yīng)(舒張)曲線。

        1.6 組織病理學(xué)

        獲得活體組織腎臟和心臟(左心室)以后,立即在10% 福爾馬林中固定,每天更換福爾馬林溶液。用酒精梯度對樣本進行脫水,在石蠟中固定。腎臟、左心室和肝臟做薄層切片(4 μm),蘇木素-伊紅(H & amp;E)染色或Masson三色染色。進行過碘酸希夫染色(PAS),以觀察近端腎小管管腔刷狀緣的緩解。用ImagePro Plus圖像分析軟件進行圖像形態(tài)學(xué)分析。

        1.7 免疫印跡

        本研究中使用的一抗包括多克隆山羊TNF-α(1∶1000)、多克隆兔抗NF-κB p50(1∶1000)、多克隆兔抗 NF-κB p52(1∶1000)、單克隆兔抗TGF-β1(1∶1000)(SantaCruzBiotechnology 公司),以及多克隆兔抗PLA2(1∶1000)、單克隆小鼠抗HO-1(1∶1000)(Abcam公司)。

        將腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)在含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中勻漿。根據(jù)蛋白濃度確定電泳上樣量,各組上樣量保持一致,以GADPH(1∶5000,Sigma-Aldrich公司)作為對照,用ImageJ圖像分析軟件分析條帶濃度。

        1.8 免疫組織化學(xué)染色

        免疫組織化學(xué)染色使用的一抗包括單克隆小鼠抗ED-1(1∶150,Serotec公司)、單克隆小鼠抗α-SMA(1∶400,Sigma公司)。免疫組織化學(xué)染色在4 μm切片上采用常規(guī)操作進行。

        1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

        數(shù)據(jù)以x±s表示,使用One way方差分析和Tukey檢驗,或Two way方差分析和Bonferroni檢驗,P<0.05認為有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。用Graph Pad Prism 5.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。

        2 結(jié)果

        2.1 不同劑量腺嘌呤飼喂對大鼠體重的影響

        0.75 % 腺嘌呤組大鼠攝食量保持恒定;0.075% 腺嘌呤組大鼠體重?zé)o明顯改變;16周時,與衰老相關(guān)的體重增加在0.25% 腺嘌呤組中更明顯;0.5% 腺嘌呤組大鼠體重?zé)o增長,0.75% 腺嘌呤組大鼠體重下降(圖1)。

        圖1 不同質(zhì)量分數(shù)腺嘌呤飼喂對大鼠體重的影響

        2.2 不同劑量腺嘌呤飼喂對大鼠收縮壓和心臟結(jié)構(gòu)的影響

        0.25 % 、0.5% 和0.75% 腺嘌呤組大鼠的收縮壓顯著增加,但0.075% 腺嘌呤組增加的程度較輕(圖2A)。0.075% 腺嘌呤組大鼠的左心室結(jié)構(gòu)無改變,但在高濃度腺嘌呤組中可觀察到明顯的纖維化和炎癥細胞浸潤(圖2B)。

        圖2 不同質(zhì)量分數(shù)腺嘌呤飼喂大鼠的血壓和心肌結(jié)構(gòu)變化

        2.3 0.25% 腺嘌呤對大鼠心血管功能的影響

        0.25 % 腺嘌呤飼喂組大鼠的收縮壓從第4周開始升高,到第8周開始穩(wěn)定。左心室剛性常數(shù)(stiffness constant)升高(32.9±1.4 vs.23.1±0.8),伴有心臟炎癥細胞浸潤及間質(zhì)和血管周纖維化。在離體胸主動脈環(huán)中,去甲腎上腺素介導(dǎo)的收縮,內(nèi)皮依賴乙酰膽堿介導(dǎo)的和平滑肌依賴硝普鈉介導(dǎo)的舒張受損(圖3)。血清甘油三酯、總膽固醇和非酯化脂肪酸升高(表1)。

        圖3 腺嘌呤飼喂和別嘌呤醇治療后,去甲腎上腺素(A)介導(dǎo)的收縮,內(nèi)皮乙酰膽堿(B)、平滑肌硝普鈉(C)介導(dǎo)的舒張功能變化

        表1 不同劑量腺嘌呤飼喂對大鼠血漿指標(biāo)的影響

        2.4 不同劑量腺嘌呤飼喂對大鼠生化指標(biāo)的影響

        不同劑量的腺嘌呤飼喂大鼠后,血漿參數(shù)和蛋白尿程度在0.75% 腺嘌呤組大鼠中較其他組更高(表2)。腎臟病理切片中,單位面積內(nèi)擴張的腎小管數(shù)、含有碎片的小管數(shù)、異常腎小球數(shù)、纖維化面積比例在0.75% 腺嘌呤組大鼠體內(nèi)也有明顯升高(數(shù)據(jù)未示)。

        2.5 應(yīng)用別嘌呤醇治療0.25% 腺嘌呤誘導(dǎo)的大鼠抑制腎組織內(nèi)多種蛋白表達

        用25 mg/(kg·d)的別嘌呤醇治療0.25% 腺嘌呤飼喂大鼠至少8周,能夠降低血漿尿酸濃度,改善腎功能,表現(xiàn)為蛋白尿、肌酐、血漿尿素氮及清除率降低。結(jié)構(gòu)上,小球損傷、炎癥和膠原沉積在別嘌呤醇治療后降低(數(shù)據(jù)未示)。別嘌呤醇治療后,腎臟 HO-1、TNF-α、PLA2、NF-κB p50、NF-κB p52和TGF-β的表達降低(圖4)。

        3 討論

        目前,科學(xué)家們廣泛接受的CKD動物模型是大鼠5/6腎切除模型[8],這種模型能夠模擬人類腎臟疾病中腎小球濾過率下降、血清肌酐和尿素氮升高、體重降低[9]的病理改變,但存在死亡率高、腎臟結(jié)構(gòu)和功能結(jié)局多變,以及剩余可用腎組織體積有限等缺點。其他CKD模型包括單側(cè)腎單次夾閉[10]、雙側(cè)腎單次夾閉、通過鏈霉素化學(xué)誘導(dǎo)糖尿病[11]和基因模型如糖尿病性肥胖db/db小鼠和ob/ob小鼠[12]。這些模型僅可復(fù)制一部分人類CKD的表現(xiàn),無法完整地復(fù)制相應(yīng)的表現(xiàn)。

        飲食中添加腺嘌呤能夠誘導(dǎo)腎臟損傷,其主要表現(xiàn)為血清肌酐和血漿尿素氮濃度升高,以及肌酐和血漿尿素氮清除率下降[5]。早期的研究表明,0.75% 腺嘌呤飼喂能夠引起顯著且迅速的病理改變[13]。我們在劑量范圍研究中已確認了這一結(jié)果,反映在人類中,即為不常見的急性進展性腎臟損傷。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)0.25% 腺嘌呤能夠在16周時誘導(dǎo)與人類CKD類似的慢性腎臟損傷。同時,我們也觀察到慢性炎癥細胞浸潤、纖維化程度升高、腎小管萎縮和擴張、腎小球損傷等病理改變,模型大鼠的血清脂質(zhì)濃度也有所升高,這可能是由于腎臟損傷引起的代謝障礙所導(dǎo)致。0.25% 腺嘌呤飼喂的大鼠出現(xiàn)了高血壓和心室膠原沉積等癥狀,但無法確認腎臟損傷和心血管系統(tǒng)損傷是同時發(fā)生還是次序發(fā)生。第4周時收縮壓升高,尿試紙檢驗提示出現(xiàn)蛋白尿;第8周時收縮壓進一步升高,尿液中開始出現(xiàn)血液或白細胞,提示腎臟和心血管疾病同時進展。

        表2 不同劑量腺嘌呤飼喂對大鼠生化指標(biāo)的影響

        圖4 腺嘌呤飼喂、別嘌呤醇治療后大鼠腎臟HO-1(A)、TGF-β(B)、TNF-α(C)、PLA2(D)、NF-κB p50(E)、NF-κB p52(F)的表達

        腎臟和心血管反應(yīng)的同時存在提示飲食中添加0.25% 腺嘌呤能夠克服許多其他CKD動物模型的缺點。相比于大鼠,小鼠可能對腺嘌呤更敏感,這還有待進一步的探討。

        腺嘌呤誘導(dǎo)的腎臟損傷可能由血漿尿酸濃度升高所致。作為一種嘌呤堿基,腺嘌呤可能通過黃嘌呤氧化酶而成為尿酸的來源之一。血漿尿酸濃度在0.25% 腺嘌呤飼喂大鼠中升高,而在別嘌呤醇治療的大鼠體內(nèi)下降。別嘌呤醇治療能夠改變0.25% 腺嘌呤飼喂大鼠的心臟和腎臟功能和結(jié)構(gòu),提示尿酸可能在心臟和腎臟病理改變中扮演主要角色。別嘌呤醇在db/db小鼠中也可改善腎臟功能并緩解小管間質(zhì)纖維化損傷[14]。

        另一個可能的參與機制是氧化應(yīng)激本身。支持這種假設(shè)的證據(jù)之一是HO-1表達水平的升高。氧化物可以誘導(dǎo)腎小球選擇性下降,細胞表型喪失、凋亡[15],內(nèi)皮細胞損傷,脂質(zhì)過氧化和炎癥細胞反應(yīng),氧化物濃度與下降的腎臟功能負相關(guān)。HO-1是人類腎臟疾病和實驗?zāi)P椭嗅槍ρ趸瘧?yīng)激的關(guān)鍵防御機制,HO-1的表達與蛋白尿和小管間質(zhì)改變的嚴重程度相關(guān)。HO-1在自由基介導(dǎo)的損傷腎臟中過表達。氧化物能夠引起足細胞損傷,而足細胞損傷是導(dǎo)致腎小球損傷和進一步硬化的關(guān)鍵因素。

        慢性腎病并發(fā)慢性心血管損傷大鼠模型的建立,為今后腎病、心血管系統(tǒng)疾病的研究提供了一種新的動物模型,其科研潛力有待進一步發(fā)掘。同樣,由于該模型的各方面相關(guān)研究資料尚不多,其穩(wěn)定性及代表性也有待考證。

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