張照研，王宇光，高月

1.北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124；2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

細(xì)胞色素 P450 7A1（cytochrome P450 7A1，CYP7A1）是細(xì)胞色素P450超家族的一個(gè)亞型，也稱膽固醇7α-羥化酶，屬于氧化還原酶類[1]。CYP7A1能將膽固醇轉(zhuǎn)化為7α-羥基膽固醇，是膽汁酸合成中的第一步和限速步驟。內(nèi)源性膽固醇和膽汁酸水平可嚴(yán)格調(diào)控CYP7A1的基因表達(dá)，以維持上述2種成分的體內(nèi)水平[2-7]，在膽酸和膽固醇代謝中起重要作用。因此，深入研究對CYP7A1具有調(diào)控作用的藥物和天然產(chǎn)物，對以膽固醇和膽酸代謝為特征的相關(guān)疾病治療具有重要價(jià)值。本研究旨在構(gòu)建以CYP7A1基因啟動(dòng)子為啟動(dòng)序列的雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，為進(jìn)一步研究中藥及其成分對CYP7A1的調(diào)控機(jī)制提供有效篩選模型。

1 材料和方法

1.1 材料

HepG2細(xì)胞購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，由本實(shí)驗(yàn)室凍存保種；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購于北京博邁德生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和HindⅢ、T4DNA連接酶、DL2000和 DL10000 DNA marker、dNTP 混合物、10×緩沖液、ExTaqDNA聚合酶、pMD19-T質(zhì)粒購于寶生物工程(大連)有限公司；LipofectAMINE 2000、TRIzol購于Invitrogen公司；PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、小量質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒購于天根生物技術(shù)公司；雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購于普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；引物由北京博邁德生物技術(shù)有限公司合成；24孔細(xì)胞培養(yǎng)板購于Corning公司；酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂粉等試劑購于Oxford公司；DMEM培養(yǎng)基購于Gibco公司；胎牛血清購于Thermo Fisher Scientific公司；胰蛋白酶購于Sigma公司；青霉素鏈霉素雙抗溶液購于HyClone公司。

PCR儀、Victor X多標(biāo)記酶標(biāo)儀（Perkin Elmer公司）；電泳儀、電泳槽設(shè)備、成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）；3110細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司）；Mi?crofuge 22R臺(tái)式高速離心機(jī)（Beckman公司)；Ax?iovert 40倒置顯微鏡（Zeiss公司）。

1.2 報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.1 目的片段獲得 從L02細(xì)胞中提取基因組DNA。設(shè)計(jì)CYP7A1啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增引物，并分別引入KpnⅠ、HindⅢ酶切位點(diǎn)，根據(jù)啟動(dòng)子ATG上游2100 bp序列及載體的多克隆位點(diǎn)信息，分別設(shè)計(jì)上游引物（GCGGTACCCCATCAGATCTCA TGAAATT，添加KpnⅠ酶切位點(diǎn)）、下游引物（GG ATCCCATGCATGATGCACATGCTA，添加HindⅢ酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增的啟動(dòng)子位置為-2058～+2。

1.2.2 CYP7A1啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增 PCR采用20 μL反應(yīng)體系（反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，36個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min）。取5 μL PCR產(chǎn)物加入1 μL 6×上樣緩沖液，用0.5% 的瓊脂糖凝膠電泳分析。將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化，將擴(kuò)增的啟動(dòng)子片段插入pUC57，構(gòu)建pUC57-CYP7A1-promoter。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將pUC57-CYP7A1-promoter與pGL3-Basic載體雙酶切，將2質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物分別回收純化后得到已含有粘性末端的載體和插入片段，用T4DNA連接酶于16℃低溫恒溫反應(yīng)槽中連接16 h，得到重組質(zhì)粒。將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，在不含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)1 h后，涂布于含氨芐青霉素的LB瓊脂糖培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12 h，挑選陽性克隆擴(kuò)增并提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，將重組質(zhì)粒進(jìn)行雙向測序拼接確定堿基序列，并進(jìn)行Blast比對。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和熒光值檢測

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 完全培養(yǎng)基由含10% 胎牛血清、100 μg/mL青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基構(gòu)成，在37℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，0.25% 胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 轉(zhuǎn)染和熒光檢測 采用轉(zhuǎn)染試劑Lipo?fectAMINE 2000進(jìn)行。取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，按每孔2.5×105細(xì)胞接種于24孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)約80% 時(shí)用Opti-MEM培養(yǎng)液稀釋質(zhì)粒。將500 ng pGL3-CYP7A1-promoterluc（采用測序無誤的質(zhì)粒2、3分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)）、50 ng pRL-TK 內(nèi)參質(zhì)粒、2 μL LipofectAMINE 2000混勻；將500 ng pGL3-Basic、50 ng pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒、2 μL LipofectAMINE 2000混勻，設(shè)置為對照組；質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑室溫孵育20 min，24孔板每孔加入100 μL混合轉(zhuǎn)染液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染6 h，吸去混合液，換含2% 胎牛血清、不含青霉素鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48 h，吸去各組培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞1次，每孔加入100 μL 1×PLB溶液，室溫靜止裂解15 min，加入100 μL LABⅡ溶液，多功能酶標(biāo)儀檢測各孔的螢火蟲螢光素酶活性；接著各孔加入100 μL Stop＆Glo試劑，啟動(dòng)海腎螢光素酶反應(yīng)后，檢測海腎螢光素酶活性，并計(jì)算熒光值比值。

圖1 CYP7A1啟動(dòng)子擴(kuò)增片段（2060 bp）凝膠電泳

圖2 pUC57-CYP7A1-promoter質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

圖3 pGL3-CYP7A1-promoter-luc構(gòu)建過程示意圖

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用軟件SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多組數(shù)據(jù)間比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)處理，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CYP7A1啟動(dòng)子擴(kuò)增的凝膠電泳測定

結(jié)果見圖1。引物設(shè)計(jì)PCR的片段大小為2060 bp，PCR產(chǎn)物凝膠電泳顯示目的條帶約為2000 bp，與CYP7A1啟動(dòng)子大小相符，表明成功擴(kuò)增了CYP7A1的啟動(dòng)子。對產(chǎn)物進(jìn)行回收后再次PCR，膠回收產(chǎn)物。

2.2 質(zhì)粒構(gòu)建

pGL3-CYP7A1-promoter-luc質(zhì)粒構(gòu)建過程如圖2、3所示。首先將克隆載體pUC57-vector與PCR擴(kuò)增的CYP7A1啟動(dòng)子連接。之后，將構(gòu)建的pUC57-CYP7A1-promoter與熒光載體pGL3-Basic vector用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、HindⅢ雙酶切（圖4），回收2060 bp的CYP7A1啟動(dòng)子片段，與pGL3-Basic載體用T4DNA連接酶連接，連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑單克隆振蕩培養(yǎng)，進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證（圖5），經(jīng)氨芐青霉素篩選得到重組熒光質(zhì)粒pGL3-CYP7A1-promoter-luc，測序。雙酶切pUC57-CYP7A1-promoter與熒光載體pGL3-Basic vector結(jié)果顯示片段大小符合預(yù)期。菌液PCR結(jié)果表明，除泳道5、11外，均鑒定為陽性克隆質(zhì)粒。測序比對發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的pGL3-CYP7A1-promoter-luc中的測序片段與CYP7A1啟動(dòng)子一致。以上結(jié)果表明成功構(gòu)建了熒光質(zhì)粒pGL3-CYP7A1-promoter-luc。

2.3 測序

構(gòu)建質(zhì)粒 pGL3-CYP7A1-promoter-luc2、3進(jìn)行雙向測序，拼接后經(jīng)Blast比對，序列與CYP7A1啟動(dòng)子相同，測序結(jié)果顯示質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖6）。

2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和螢光素酶活性測定

分別將pGL3-CYP7A1-promoter-luc2、3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，6 h后換含2% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h后檢測熒光，計(jì)算熒光值比值，分別與對照組（pGL3-Basicvector）進(jìn)行組間t檢測。轉(zhuǎn)染pGL3-CYP7A1-promoter-luc2質(zhì)粒24、48 h后，熒光響應(yīng)值分別為對照組的13.1±2.8倍（P＜0.001）和23.3±2.9倍（P＜0.001）；轉(zhuǎn)染 pGL3-CYP7A1-promoterluc3質(zhì)粒24、48 h后，熒光響應(yīng)值分別是對照組的8.4±1.6倍（P＜0.001）和22.1±1.9（P＜0.01）倍；結(jié)果均有顯著性差異（圖7），表明質(zhì)粒pGL3-CYP7A1-promoter-luc2、3均能響應(yīng)。

3 討論

圖4 pUC57-CYP7A1-promoter和pGL3-Basic vector的雙酶切

圖5 瓊脂糖凝膠檢測菌液PCR擴(kuò)增片段

圖6 質(zhì)粒2測序示意圖（-20～175 bp）

圖7 螢光素酶活性測定

報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物為特定蛋白質(zhì)或酶，可被檢測和鑒定，從而間接反映基因調(diào)控的效率和特異性。報(bào)告基因在表達(dá)過程中對細(xì)胞或動(dòng)物正常的生理作用或活性沒有影響。常用的報(bào)告基因有螢光素酶基因、綠色和紅色熒光蛋白基因等[8]。報(bào)告基因法在病毒檢測和抗病毒藥物篩選等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[9-11]。本實(shí)驗(yàn)室前期曾構(gòu)建過CYP1A1、CYP2B6、CYP3A4等熒光報(bào)告基因載體，并對烏頭堿[12]、補(bǔ)骨脂[13]、人參皂苷[14]、麥冬皂苷[15]等成分進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)了中藥的配伍以及中藥有效成分對藥物代謝酶的影響規(guī)律，為相關(guān)中藥的臨床應(yīng)用提供了重要依據(jù)。筆者采用實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的CYP3A4啟動(dòng)子的熒光報(bào)告基因質(zhì)粒對何首烏的成分進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)其中成分具有上調(diào)和下調(diào)CYP3A4的作用，該研究為何首烏在臨床合理使用提供了實(shí)驗(yàn)層面的參考[16-17]。

膽固醇7α-羥化酶是體內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸的經(jīng)典合成途徑的第一限速酶[18]，催化膽固醇為7α-羥化膽固醇。膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸是其代謝的主要途徑[19-20]。CYP7A1表達(dá)除受晝夜節(jié)律及基因多態(tài)性影響外，還可被激素、細(xì)胞因子等多種因素調(diào)控。其表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，受到包括 FXR、HFN-4α、SHP、SREBP-1C、PGC-1α等諸多核因子調(diào)控。中藥及其方劑對調(diào)脂和降低膽固醇具有較好的療效。近來有轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明，何首烏通過上調(diào)膽固醇和膽酸生物合成的關(guān)鍵酶CYP7A1從而產(chǎn)生肝損傷[21]。相比于轉(zhuǎn)錄組學(xué)通量大耗時(shí)長，螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)具有檢測速度快、靈敏度高、結(jié)果確切等優(yōu)點(diǎn)，在藥物篩選、疾病檢測等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。中藥方劑和有效成分能通過調(diào)控CYP7A1，調(diào)解體內(nèi)膽酸和膽固醇的穩(wěn)態(tài)，從而發(fā)揮降脂治療膽結(jié)石等藥效[22-26]。探討中藥及其成分對CYP7A1的調(diào)控方式十分重要，構(gòu)建的CYP7A1啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告基因載體為這一研究提供了新的工具。

綜上，我們構(gòu)建了CYP7A1啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告基因載體，下一步將利用構(gòu)建的載體研究中藥成分對CYP7A1的調(diào)控，以期發(fā)現(xiàn)其對內(nèi)源性膽酸合成代謝的影響。