冷曉燕，段云飛，段穎，徐燕，常菁

江蘇邁健生物科技發(fā)展股份有限公司，江蘇 無錫 214000

創(chuàng)面愈合是一個復(fù)雜的過程，涉及皮膚缺損部位的再上皮化、肉芽組織的增生、炎癥反應(yīng)、血管增生和創(chuàng)面重塑等，其中任何一個過程出現(xiàn)問題，都會導(dǎo)致創(chuàng)面愈合障礙[1-2]。在創(chuàng)面愈合過程中，生長因子扮演著非常重要的角色，這是由于它們在體外具有獨特的、能夠刺激靜止期細胞持續(xù)進行有絲分裂的能力，在這一復(fù)雜的過程中，生長因子的調(diào)控非常精細，它們能對傷口愈合的各個時期產(chǎn)生影響，從而加快愈合速度[3]。然而，應(yīng)用高劑量單一因子治療難愈性創(chuàng)面雖然能在一定程度上緩解患者病情，但調(diào)控機制單一，且價格昂貴，因此限制了其臨床應(yīng)用。有學(xué)者對臍帶來源的干細胞上清液中的成分進行了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）實驗分析，結(jié)果表明該上清液中含有多種細胞因子，如大量的IL-6、IL-8、MCP-1、TIMP-1、GM-CSF、TGF-β1等[4]，這些因子在創(chuàng)面愈合過程中非常重要。

本實驗中，我們將人臍帶間充質(zhì)干細胞（hu?man umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）上清凝膠直接作用于活體創(chuàng)面，觀察是否會影響創(chuàng)面的再次上皮化、肉芽組織增生、炎癥反應(yīng)、血管增生和創(chuàng)面重塑等過程，探討干細胞上清對小鼠創(chuàng)面愈合的影響，研究hUC-MSCs上清與動物創(chuàng)面愈合的關(guān)系，以及促進創(chuàng)面愈合的合理蛋白含量，旨在為臨床促進創(chuàng)面愈合尋找新的藥物和新的治療方法。

1 材料和方法

1.1 材料

健康新生兒臍帶取自解放軍101醫(yī)院婦產(chǎn)科足月剖宮產(chǎn)的胎兒；雌性ICR小鼠40只，體質(zhì)量25～30 g，由蘇州大學(xué)實驗動物中心提供；α-MEM、胎牛血清（FBS）（BI公司）；CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR單克隆抗體（BD公司）；RNA Simple Total RNA kit、Quantscript RT kit（大連寶生物公司）；動物組織總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒（天根公司）；常規(guī)生化試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品；流式細胞儀（BD公司）；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 hUC-MSCs的分離培養(yǎng)

從手術(shù)室取得新鮮健康新生兒臍帶，用PBS沖洗干凈，用剪刀鑷子剔去血管，剝出里面的華氏膠組織，充分剪碎至1 mm3大小，加入α-MEM培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含10% FBS，待細胞長滿后，用0.25% 胰蛋白酶消化傳代。

1.3 流式細胞儀檢測

將原代細胞消化下來后，加PBS調(diào)整細胞濃度至1×106/mL，取200 μL細胞懸液按組合方案分別加入5 μL熒光標記的單抗（CD90-FITC、CD45-FITC、CD73-PE、CD34-PE、HLA-DR-PE、CD105-PE）混勻，室溫避光孵育20 min，上機檢測。

1.4 成骨成脂細胞分化

取第3代細胞消化傳代后，以約1.0×105/孔接種到6孔板中，成脂、成骨分化及對照各2孔，待細胞貼壁后，向分化組加入相應(yīng)的分化培養(yǎng)液。成骨分化培養(yǎng)基中含1.0×10-7mol/L地塞米松、50 μg/mL抗壞血酸、10 mmol/L β磷酸甘油；成脂分化培養(yǎng)基中含10-6mol/L地塞米松、0.5 mmol/L 1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤、50 μg/mL抗壞血酸、10 μg/mL胰島素注射液、0.2 mmol/L吲哚美辛。每3～4 d換液1次，分化4周后，用4% 低聚甲醛將細胞固定，分別用茜素紅染液和油紅O染色，蘇木精復(fù)染，于顯微鏡下觀察。

1.5 RT-PCR檢測Oct4、Sox2的表達

直接向6孔板的每孔細胞內(nèi)加1 mL TRN?zol，吹打混勻后用氯仿-異丙醇法提取總RNA，采用TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR引物見表1。反應(yīng)條件：95℃ 5 min，以95℃變性30 s、不同溫度退火30 s、72℃延伸30 s行35個循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.6 hUC-MSCs上清液的收集

當(dāng)?shù)?代細胞長至70% 匯合度時，用不含血清的干細胞培養(yǎng)基（α-MEM）培養(yǎng)48 h，收集細胞上清液，用蛋白電泳方法檢測胎牛血清殘留量，以將胎牛血清耗盡的培養(yǎng)時間為止，將收集的液體1000 r/min離心5 min，分裝到15 mL離心管中，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 hUC-MSCs上清液粗提純及總蛋白濃度檢測

采用硫酸銨沉淀法進行鹽析，收集蛋白沉淀，加水溶解后過濾，將葡聚糖凝膠柱G-25（5 cm×60 cm）連接AKTA蛋白純化儀，用含0.15 mol/L NaCl的去離子水作為洗脫劑，對溶液進行過濾除鹽、脫色處理。將收集到的樣品用0.22 μm濾膜過濾后于4℃保存?？偟鞍诐舛葯z測采用BCA法。

表1 GAPDH、Oct4、Sox2引物序列

1.8 凝膠劑的制備

將收集到的純化上清用凍干機凍干成粉，用無菌水將凍干粉溶解為濃度19 g/L的蛋白凝縮液。3% 甲基纖維素（MC）與1.3 g/L純化上清等體積混合即為低劑量凝膠劑，3% MC與19 g/L純化上清（凍干濃縮而成）等體積混合即為高劑量凝膠劑。

1.9 小鼠皮膚損傷模型的建立

將ICR小鼠用4% 水合氯醛麻醉，用剃毛器除去背部被毛，采用5 mm皮膚打孔器于小鼠背部制備2個對稱的皮膚創(chuàng)傷模型。將實驗動物隨機分成空白對照組（10只，實驗期間傷口不給予任何處理）、溶劑對照組（10只，實驗期間傷口給予3% 甲基纖維素處理）、實驗材料組［共20只，分為Ⅰ組（10只，實驗期間傷口給予低劑量凝膠劑處理）、Ⅱ組（10只，實驗期間傷口給予高劑量凝膠劑處理）］。

1.10 創(chuàng)面愈合率

進行上述實驗后小鼠分籠飼養(yǎng)，每天觀察進食情況、創(chuàng)面變化及愈合情況，計算創(chuàng)面愈合率。

1.11 組織學(xué)分析

第3、6、8、15 d留取各組切口處含兩側(cè)1 cm范圍圈層皮膚組織制作石蠟切片，HE染色，評估不同組別切口愈合的大體情況。第3、6、8、15 d留取各組切口處含兩側(cè)1 cm范圍圈層皮膚組織制作石蠟切片，Masson三色染色，評估不同組別切口愈合過程中膠原形成的大體情況。

1.12 愈合組織相關(guān)因子表達的檢測

白細胞介素1β（IL-1β）是具有代表性的炎性因子，成纖維細胞生長因子β1（TGF-β1）是成纖維細胞的強力生長因子，VEGF為血管內(nèi)皮生長因子。另外，Ⅰ型膠原（Col1）是機體主要的結(jié)構(gòu)膠原，由2條α1鏈（Col1a1）和1條α2鏈（Col1a2）組成三螺旋結(jié)構(gòu)[5]。Col1a1在Ⅰ型膠原合成過程中起著極其重要的作用，而皮膚創(chuàng)傷愈合過程也與膠原纖維的形成息息相關(guān)[6]。我們采用動物組織總RNA提取試劑盒提取愈合組織總mRNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建cDNA文庫。Q-PCR檢測則借助熒光定量PCR試劑盒，設(shè)置程序：95℃預(yù)變性15 min；95℃ 10 s、55℃ 20 s、72℃ 30 s，40次循環(huán)；擴增反應(yīng)完成后進行熔解曲線制作，確保擴增的特異性。引物序列見表2。

表2 TGF-β1、Col1a1、VEGF、IL-1β、β-actin引物序列

2 結(jié)果

2.1 細胞增殖形態(tài)改變

臍帶組織培養(yǎng)5～7 d后，可見有部分細胞從組織塊周圍爬出，形態(tài)呈細小的梭形，1周后細胞開始迅速增殖，形成大小不等的細胞集落，10 d左右去掉組織塊，15 d左右可鋪滿培養(yǎng)瓶的90% 。傳代后的細胞呈纖維狀生長，如圖1。

圖1 第3代hUC-MSCs（100×）

2.2 流式細胞儀檢測

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，hUC-MSCs高表達CD73、CD90、CD105，不表達CD34、CD45、HLADR（圖2）。

圖2 流式細胞儀鑒定原代hUC-MSCs表面標志物的表達

2.3 成骨成脂分化

成脂誘導(dǎo)分化1周后，顯微鏡下可見胞質(zhì)內(nèi)有少量脂滴形成，4周后，油紅O染色可見胞質(zhì)內(nèi)有較多油滴空泡；成骨分化4周后，細胞大量重疊成團處被染成深紅色的“鈣結(jié)節(jié)”（圖3）。

圖3 hUC-MSCs成脂（A）和成骨（B）體外誘導(dǎo)分化

2.4 Oct4、Sox2的表達

RT-PCR后電泳檢測顯示，第2代和第5代hUC-MSCs都表達Oct4和Sox2（圖4）。Oct4、Sox2是胚胎干細胞表面標志基因，對維持干細胞特性具有重要作用，表明hUC-MSCs具有干細胞特性。

2.5 術(shù)后小鼠創(chuàng)面的愈合情況

2.5.1 小鼠皮膚創(chuàng)面的宏觀所見 打孔造模當(dāng)天，創(chuàng)口邊緣整齊，傷口紅腫，可見明顯出血及滲液，創(chuàng)口較為濕潤；第1 d，創(chuàng)口已無滲血、滲液，創(chuàng)口皮膚干燥，大部分小鼠傷口可見一層膜狀物，少數(shù)已結(jié)痂；第2 d，各組小鼠傷口均可見完整痂皮覆蓋，顏色較淺，質(zhì)地較軟；第3 d，傷口邊緣開始收縮，起皺，傷口周圍紅腫消退；第4 d，痂皮顏色普遍加深，傷口面積明顯縮?。坏?～7 d，痂皮與創(chuàng)緣皮膚分離，部分已剝脫，創(chuàng)口表面由增生的上皮覆蓋，傷口面積進一步縮小；第8～9 d，痂皮陸續(xù)脫落，愈合程度快慢不一；第10 d，所有小鼠痂皮都已脫落，傷口呈線形愈合，明顯短縮；第15 d，創(chuàng)口已完全愈合，部分小鼠創(chuàng)口皮膚稍隆起，質(zhì)地較韌。

2.5.2 創(chuàng)面愈合時間和創(chuàng)面愈合率 每天觀察各組動物的創(chuàng)面愈合情況，以完全上皮覆蓋作為創(chuàng)面愈合時間的依據(jù)。每組于傷后1、3、5、7、9 d隨機取5只ICR小鼠進行創(chuàng)面拍照（圖5），用Im?age J圖像分析軟件，用手動方式標記未愈合創(chuàng)面的邊緣，運用軟件自動算出愈合創(chuàng)面的大小。創(chuàng)面愈合率=（最初創(chuàng)面大小-未愈合創(chuàng)面大?。?最初創(chuàng)面大小×100% 。不同時間點的創(chuàng)面愈合率見表3，將不同時間點的3組創(chuàng)面愈合率分別與空白對照組進行配對t檢驗，高劑量組于創(chuàng)傷后第5 d創(chuàng)面愈合率為67.1% ±6.6% ，第7 d為78.1% ±5.8% ，均分別顯著高于空白對照組第5 d（58.6% ±12.6% ）和第7 d（71.8% ±9.2% ），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），第3、9 d的創(chuàng)面愈合率無明顯差別。

圖4 hUC-MSCs的Oct4和Sox2基因RT-PCR檢測結(jié)果電泳圖

圖5 小鼠皮膚創(chuàng)面愈合情況

2.6 組織學(xué)分析

2.6.1 HE染色 常規(guī)HE染色可見，第3 d血痂與已經(jīng)增厚的創(chuàng)緣皮膚分離，創(chuàng)面可見明顯的肉芽組織形成，梭形成纖維細胞開始增生，各組差異不明顯；第6 d實驗組成纖維細胞數(shù)量較對照組多，總體來說細胞數(shù)量減少，各組小鼠傷口處仍有厚痂，但已開始剝離傷口；第8 d創(chuàng)面周圍明顯上皮化，創(chuàng)面面積明顯縮小，實驗組（高劑量和低劑量組）已填滿整個傷口區(qū)域，對照組可見肉芽組織形成，但不完整；第15 d創(chuàng)口（圖6）基本愈合，原先的創(chuàng)口已完全被表皮覆蓋，表皮均質(zhì)變薄，低劑量組傷口寬度明顯小于對照組，高劑量組傷口處細胞層次變多，更接近于正常皮膚組織，少數(shù)高劑量組個體傷口處出現(xiàn)毛囊汗腺等皮膚附屬器官。

2.6.2 Masson染色 創(chuàng)面新生組織切片經(jīng)Masson三色染色后觀察，傷后3～8 d出現(xiàn)肉芽組織，膠原纖維增生不明顯；傷后15 d，膠原纖維增生顯著（圖7，箭頭示膠原纖維，呈藍色）。空白組和MC組術(shù)后15 d，新生真皮膠原積累松散，多呈彌漫狀，規(guī)則積累的膠原蛋白較少。低劑量和高劑量組真皮有粗大并明顯走向的膠原纖維，真皮膠原積累優(yōu)于對照組。

2.7 分子水平檢測愈合組織相關(guān)因子的表達

實時定量PCR檢測小鼠皮膚切創(chuàng)傷口組織中TGF-β1、Col1a1、VEGF、IL-1β基因的相對表達量，結(jié)果見圖8。傷后第2 d，高劑量上清處理的小鼠傷口組織TGF-β1和Col1a1基因表達增加，明顯多于對照組（P＜0.05），到第3 d時降至正常水平，與空白對照組相比無顯著差異。此外，傷后第3 d，實驗組（高劑量和低劑量組）VEGF的表達量均高于對照組，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而IL-1β基因的表達，可以看到高劑量組從第3 d開始顯著低于空白對照組，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 不同時間點ICR小鼠創(chuàng)面愈合率（% ）

3 討論

研究表明，機體組織在損傷的每個時期都有不同的細胞因子在發(fā)揮作用，如引起組織收縮、誘導(dǎo)炎性細胞浸潤、決定浸潤炎癥細胞的種類、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的程度、誘導(dǎo)纖維母細胞分化及肉芽組織形成、誘導(dǎo)上皮組織形成等。因此，檢測對照組與實驗組損傷處組織中各種與損傷修復(fù)相關(guān)細胞因子的表達情況可以反映出創(chuàng)傷愈合的作用機制，即通過什么途徑促進傷口愈合[7]。通過創(chuàng)面愈合率的計算，我們發(fā)現(xiàn)傷后的初期和后期，各組小鼠傷口面積差異不明顯，傷口愈合依賴于各基因表達產(chǎn)物來有序調(diào)控，而表達產(chǎn)物的積累需要一定的時間，所以早期高劑量組和對照組傷口愈合率無差異，而小鼠皮膚自身具有很強的修復(fù)能力，到了后期，即便對照組傷口也已基本愈合，所以9 d時高劑量組與對照組也無明顯差異。在3～9 d之間，高劑量組的優(yōu)勢在外觀上得以顯示，愈合率顯著高于空白對照組。病理切片使我們能夠觀察到傷口深層次的變化，初期各組病理形態(tài)大體相同，此后實驗組同期的修復(fù)情況要好于對照組，體現(xiàn)在成纖維細胞數(shù)量更多，肉芽組織出現(xiàn)得更早更明顯。Masson染色可以幫助我們更好地觀察膠原纖維的積累，藍色越深代表膠原纖維越多。已有研究證實，VEGF可以促進炎性細胞的聚集，刺激多種炎性分子的釋放，提高血管的通透性，從而加重炎性反應(yīng)。而持續(xù)的炎性反應(yīng)可能刺激成纖維細胞增殖和分泌大量的膠原，從而促進了病理性瘢痕的形成。在15 d的Masson病理切片上，我們看到實驗組的藍色更深，膠原的積累是瘢痕形成的物質(zhì)基礎(chǔ)[8]，我們處死小鼠前還未見到傷口出現(xiàn)明顯的瘢痕疙瘩，因為事實上瘢痕的形成需要更長的時間。

圖6 小鼠皮膚創(chuàng)面愈合15 d（HE染色，箭頭示創(chuàng)面位置）

圖7 小鼠皮膚創(chuàng)面愈合15 d（Masson染色）

圖8 實時定量PCR檢測傷后不同時間點TGF-β1、Col1a1、VEGF、IL-1β基因表達水平變化

由實時定量PCR結(jié)果，可以推測在小鼠皮膚創(chuàng)傷發(fā)生后的早期，也就是第2～3 d，我們制備的干細胞上清凝膠促進了TGF-β1、Col1a1、VEGF基因的表達。TGF-β1能直接刺激成纖維細胞外基質(zhì)蛋白（包括纖維連接蛋白）、膠原、氨基葡糖等的合成，并對新合成的細胞基質(zhì)的降解具有明顯的抑制作用；局部注射TGF-β1可以促進傷口愈合和典型肉芽組織形成[9]。TGF-β1作為趨化因子，推動成纖維細胞生長、膠原積累。Col1a1表達量增加又進一步加速了膠原的形成。創(chuàng)傷修復(fù)須經(jīng)歷炎性反應(yīng)、肉芽組織形成及組織重塑等主要階段，每一階段都有血管及其相關(guān)生物活性物質(zhì)的參與，新生血管對于創(chuàng)面愈合起著至關(guān)重要的作用，為快速生長的細胞提供氧氣和營養(yǎng)支持，以促進創(chuàng)傷組織的修復(fù)[8]。VEGF與肉芽組織中血管內(nèi)皮細胞上的血管內(nèi)皮細胞因子受體作用，促進內(nèi)皮細胞分化增殖和遷移，促進血管構(gòu)建和生成。在造模后3 d，我們從病理切片上確實觀察到此時大量肉芽組織形成和成纖維細胞的聚集，與實時定量PCR結(jié)果相印證。這些作用都加快了實驗組，特別是高劑量組小鼠創(chuàng)面的修復(fù)速率。同時我們還發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷修復(fù)后期，高劑量組的IL-1β這一炎癥因子表達水平降低。已有研究表明，小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合初期，傷口出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤，隨著傷口愈合，炎性細胞逐漸減少直至消失[10]。據(jù)此推測，高劑量的hUC-MSCs上清凝膠加速了傷口愈合，使得炎癥反應(yīng)提前消退，炎性細胞在高劑量組小鼠傷口組織中更早消失。本實驗初步證實了人臍帶來源干細胞上清凝膠能夠有效加速小鼠皮膚創(chuàng)面愈合，但其具體機制還須深入研究。