廖翔，何景龍，李洪波

北京美萊博醫(yī)學科技有限公司，北京 100071

犬細小病毒（Canine parvovirus，CPV）屬于細小病毒科，于1978年分離自患腸炎的犬類糞便。CPV感染會引起犬細小病毒腸炎，是全球范圍流行的犬類烈性傳染病之一[1]，同時也是包括大熊貓在內的珍稀瀕危動物的主要烈性傳染病。其病程短、傳染性強、死亡率高，對犬類危害很大，需要有快速準確的檢測方法，以便及時治療。

目前CPV的快速檢測方法主要有基于血清蛋白的免疫性檢測[2]和針對病毒DNA的基因檢測?；驒z測包括常規(guī)PCR擴增和熒光定量PCR檢測[3]，以及近幾年發(fā)展較快的環(huán)介導等溫擴增（loopmediated isothermal amplification,LAMP）[4-7]。

LAMP[8]是Notomi等發(fā)明的一種恒溫擴增方法，其特點是降低了對儀器的要求，只需要一個水浴鍋等恒溫設施即可反應。然而，常規(guī)LAMP仍需要專門的檢測設備，不便現場檢測。

根據DNA聚合酶在擴增過程中每延伸一個堿基會釋放一個氫離子，從而使溶液pH值逐漸降低的原理，我們建立了一種pH敏感指示劑中性紅檢測犬細小病毒的LAMP方法。本方法只需恒溫擴增儀器，即恒溫水浴或金屬浴，不需要檢測儀器，40 min完成LAMP，陰性反應保持初始淡黃色狀態(tài)，陽性擴增反應液則會變?yōu)樽霞t色，肉眼即可分辨陽性擴增和陰性反應，非常方便現場快速病毒檢測。

1 材料和方法

1.1 材料

犬細小病毒DNA樣品由軍事醫(yī)學研究院軍事獸醫(yī)研究所惠贈；金黃色葡萄球菌、宋內志賀菌、坂崎腸桿菌、單增李斯特菌、大腸桿菌的DNA由浙江省質量檢測科學研究院惠贈；標準質粒pUC-CPV由上海捷瑞公司合成；1×RM LAMP（含Eva Green）反應液、可視化1×RM LAMP（含中性紅）反應液和2×PCR TaqMix由北京美萊博醫(yī)學科技有限公司生產；DL2000 DNA marker為廣州東盛生物科技有限公司產品；Bst2.0 DNA聚合酶購自NEB公司；熒光定量PCR儀為Roche公司的LightCycler 480II。

1.2 引物設計和合成

采用Primer Premier 5.0程序設計LAMP引物CPV-F3（5′-TGGGATAAAGAATTTGATACTGA-3′）、CPV-B3（5′-TGAGAGGCTCTTAGTTTAGCTTT-3′）、CPV-FIP（5′-CGCAACTTTTACAAATAATTGACCATT AAAACCAAGACTTCATGTAAATGC-3′）、CPV-BIP（5′-AACAAATGAATATGATCCTGATGCAACCTTTCC ACCAAAAATCTGAGT-3′）、CPV-FLP（5′-GGACAAT TATTTTGACAAACAAATGG-3′）、CPV-BLP（5′-TCT GCTAATATGTCAAGAATTGTAAC-3′），由上海捷瑞公司合成。

國標犬細小病毒病診斷技術[9]上游引物為CPVF（5′-GAATCTGCTACTCAGCCACCAAC-3′），下游引物為 CPVR（5′-GTGCACTATAACCAACCTCAGC-3′），由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。

用純水將所有引物溶解為100 μmol/L濃度的母液，然后配制LAMP用引物混合物CPV-PM，含 CPV-FIP、CPV-BIP 各 32 μmol/L，CPV-FLP、CPV-BLP、CPV-F3和 CPV-B3各 4 μmol/L。每20 μL LAMP 反應體系加入1 μL CPV-PM。國標引物根據國標要求配制。

1.3 標準質粒的制備

捷瑞公司合成并提供的pUC-CPV質粒為5 μg干粉，用50 μL純水溶解，濃度為100 ng/μL。質粒大小為3200 bp，其相對分子質量計算為3200×660=2.1×106。根據公式［質?？截悢?（質量濃度÷分子量）×6.02×1023］計算拷貝數，將質粒稀釋至1×103、1×102、1×101拷貝/μL作為擴增反應的陽性對照標準品。

1.4 實時熒光定量LAMP

每 17 μL 1×RM LAMP 反應液中加入 1 μLBst2.0 DNA聚合酶、1 μL CPV-PM、1 μL pUC-CPV標準質粒，混勻后加入384孔板，蓋上透明封口膜，置LightCycler 480II中進行LAMP反應和高分辨熔解曲線（HRM）分析。檢測模式為SYBR Green I/HRM Dye，LAMP條件為65℃恒溫反應60 min，每20 s檢測1次熒光值；擴增后直接進行HRM分析，溫度范圍60～95℃，分辨率為每攝氏度讀取熒光5次。

1.5 可視化LAMP檢測方法

每17 μL可視化LAMP 1×RM反應液中加入1 μLBst2.0 DNA 聚合酶、1 μL CPV-PM、1 μL pUC-CPV標準質粒，混勻后于65℃恒溫烘箱中反應40 min，肉眼觀察擴增結果，拍照記錄。

1.6 病毒樣本檢測和測序驗證

分別用可視化LAMP和實時熒光定量LAMP檢測犬細小病毒DNA樣品。對于檢測為陽性的樣品，用引物CPV-F3和CPV-B3進行普通PCR擴增，委托測序公司對擴增產物進行測序驗證。

1.7 國標方法檢測病毒樣本

用國標犬細小病毒檢測技術[9]檢測犬細小病毒的DNA，PCR完成后進行電泳，并拍照記錄。

1.8 可視化LAMP檢測方法特異性試驗

用本研究建立的可視化LAMP方法對犬細小病毒陽性DNA及金黃色葡萄球菌、宋內志賀菌、坂崎腸桿菌、單增李斯特菌、大腸桿菌的DNA進行特異性檢測，并將反應結果拍照記錄。

報警裝置采用模塊化設計,包括聲光報警單元、電量檢測模塊、充電保護模塊、RF433射頻模塊、GPRS通信模塊、北斗/GPS定位模塊、電池模塊和MSP430單片機模塊。聲光報警單元主要用于本地報警和狀態(tài)指示;電量檢測模塊對報警裝置的電池電量進行檢測;充電保護模塊用于為電池充電,具有過充保護;RF433射頻模塊用于檢測裝置與報警裝置的無線通信;GPRS通信模塊用于報警裝置與后臺服務器的數據通信;北斗/GPS定位模塊用于獲取報警裝置的位置數據;電池模塊用于為報警裝置提供電能。報警裝置安裝有鋰電池,同時能夠進行外部供電,其電池能夠保證報警裝置斷電后工作6 h。

2 結果

2.1 犬細小病毒檢測靶序列的確定

通過77個不同犬細小病毒全基因組的數據比對，從中找出一段433 bp的高度保守序列：

2.2 實時熒光定量LAMP的靈敏度

為避免LAMP后進行電泳容易導致的氣溶膠污染問題及離心看沉淀容易導致的誤判問題，特采用實時熒光定量PCR儀配合熒光染料Eva Green進行實時定量LAMP和高分辨率熔解曲線分析。以1/10梯度稀釋的質粒標準品和水作為模板，進行實時熒光定量犬細小病毒LAMP檢測。

用1×103、1×102、1×101拷貝/μL模板和空白對照進行擴增。從圖1可見，3個加水的空白對照孔無擴增信號，1×103～1×101拷貝/μL 模板進入對數期的時間在15 min以內，而且反應時間隨模板濃度降低依次遞增，符合模板濃度與擴增速度的對應規(guī)律。犬細小病毒LAMP檢測靈敏度低至101拷貝/μL的質粒標準品。圖2的HRM分析結果表明 LAMP 反應的特異性很好，1×103～1×101拷貝/μL模板擴增產物的Tm值都在同一個溫度區(qū)間，說明產物完全一致。

圖1 實時熒光定量LAMP檢測犬細小病毒質粒標準品的擴增曲線

2.3 可視化LAMP擴增的靈敏度

用pH敏感指示劑中性紅檢測LAMP，中性紅在擴增反應前pH8.0左右的反應液中呈淡黃色，而LAMP后反應液的pH值會下降到7.6以下，此時中性紅變?yōu)榈霞t色。

用1×103、1×102、1×101拷貝/μL模板和空白對照進行擴增。從圖3可見，反應40 min時，3個濃度模板的擴增反應液均變成了淡紫紅色，而空白對照反應仍為淡黃色?？梢暬疞AMP擴增靈敏度和實時熒光定量LAMP擴增靈敏度相同。

圖2 實時熒光定量LAMP檢測犬細小病毒質粒標準品的熔解曲線

2.4 可視化LAMP檢測方法的特異性

因犬細小病毒為DNA病毒，與RNA病毒的反應體系差異較大，故特異性實驗選用了金黃色葡萄球菌、宋內志賀菌、坂崎腸桿菌、單增李斯特菌、大腸桿菌的DNA作為對照樣品。圖4可見，只有犬細小病毒發(fā)生了顏色變化，而其他DNA及水沒有擴增信號，說明本檢測方法特異性強。

2.5 病毒樣本檢測和測序驗證

用實時熒光定量LAMP和建立的可視化LAMP法檢測了50份疑似犬細小病毒DNA樣品。熒光檢測染料擴增結果（圖5）表明其中35份樣品為犬細小病毒陽性，與圖6可視化檢測結果一致；HRM分析結果（圖7）表明陽性樣品的擴增產物Tm值一致，且和圖2質粒擴增Tm值一致,說明反應產物相同。

圖3 可視化LAMP檢測犬細小病毒標準質粒

圖8 為用國標法檢測50個樣品DNA的電泳圖，擴增長度為609 bp，檢測結果同可視化檢測與熒光檢測完全一致。用引物CPV-F3和CPVB3進行普通PCR擴增，委托北京天一輝遠生物科技有限公司測序（圖9），并對擴增產物進行比對驗證，結果表明陽性樣品含有犬細小病毒DNA序列，且15個LAMP檢測陰性樣品不含犬細小病毒序列，表明本方法和國標檢測的符合度為100% 。

圖4 可視化LAMP檢測犬細小病毒方法特異性試驗

圖5 實時熒光定量LAMP檢測疑似犬細小病毒擴增曲線

圖6 疑似犬細小病毒DNA的可視化LAMP檢測

圖7 疑似犬細小病毒樣品DNA的實時熒光定量LAMP熔解曲線

圖8 疑似犬細小病毒樣品DNA的國標檢測結果

圖9 犬細小病毒可視化LAMP檢測陽性DNA樣品PCR產物測序圖譜

3 討論

我們建立了一種高效、準確且方便的犬細小病毒檢測方法。該方法不需要昂貴復雜的儀器，一個金屬浴或水浴鍋即可進行反應；判斷結果不需要任何儀器，肉眼即可判斷陰性和陽性樣品。

pH值在擴增前后的變化是本可視化檢測的基礎，因此本方法采用的擴增體系是非緩沖體系，而非緩沖體系對引物的要求較高。我們共設計了6套擴增引物，結果3套沒有擴增信號，2套引物的擴增效率低。擴增超過80 min時，陰性對照也會出現顏色變化而影響對實驗結果的判斷，所以廣泛篩選引物是實驗成功與否的關鍵。我們同時應用了溴百里香酚藍和甲酚紅作為pH指示劑，均因顏色變化不明顯而放棄。

我們建立的方法操作簡單，無須專業(yè)訓練即可使用；擴增后無須開蓋，肉眼便可判定檢測結果，從而避免了產物污染的問題。本方法可用于虎與大熊貓的野外或基層犬細小病毒檢測，也可以用于寵物貓與狗的家庭化犬細小病毒檢測。用本方法可以開發(fā)多種細菌和病毒的檢測試劑盒，可有效提高對傳染病的防控能力。