劉曉陽，劉凌志，李彤，汪建華，張惟材，田威，熊向華

1.沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110016；2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071

好氧生物體在代謝過程中，體內(nèi)會持續(xù)產(chǎn)生一系列活性氧（reactive oxygen species，ROS），如超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧化氫等?；钚匝蹩梢杂绊慏NA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物大分子的調(diào)節(jié)，其過度累積會引起DNA損傷，抑制細胞內(nèi)酶的活性，甚至導(dǎo)致細胞死亡[1-3]。為應(yīng)對活性氧導(dǎo)致的氧化損傷并維持機體氧化還原穩(wěn)態(tài)，好氧生物體發(fā)展出了高效的抗氧化酶保護系統(tǒng)[4]。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是重要的抗氧化酶，能夠?qū)?、胞質(zhì)和線粒體基質(zhì)中的超氧陰離子自由基降解為過氧化氫和氧氣[5]。依照其在細胞中的作用位置，可將SOD分為3種，即定位于細胞質(zhì)的SOD1、定位于線粒體的SOD2和定位于細胞外的SOD3。其中，SOD1占SOD總量的90%[6]，是穩(wěn)定性最高的SOD[4]，廣泛分布于真核生物中。SOD1發(fā)揮生物活性時需要依賴銅離子和鋅離子[7]，故也被稱為銅鋅超氧化物歧化酶。SOD1的異?？梢砸鸷醚跎矬w各種不良癥狀。Muller等研究發(fā)現(xiàn)，缺乏SOD1的小鼠會出現(xiàn)肌肉量流失、白內(nèi)障、黃斑變性、胸腺退化的癥狀，甚至壽命縮短[8]；人家族性肌萎縮性側(cè)索硬化癥也與SOD1基因突變相關(guān)，且SOD1基因的單一突變就足以引發(fā)該疾病，其中涉及的確切分子機制尚不清楚[9-11]。SOD1已經(jīng)應(yīng)用于藥物、化妝品領(lǐng)域，因此在體外獲取大量具有活性的SOD1具有重要意義。我們利用麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose binding protein，MBP）融合表達的方式，經(jīng)親和層析、蛋白酶切和分子篩層析純化獲得了有活性的人銅鋅超氧化物歧化酶（HuSOD1），為HuSOD1的機制和應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌感受態(tài)細胞 DH5α、BL21（DE3）購自北京天根生化科技有限公司；pMAL-p5x質(zhì)粒由本實驗室保存；HuSOD1基因由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自康為世紀生物試劑有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；因子Ⅹa、T4DNA連接酶購自NEB公司；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和EcoRⅠ、DNA凝膠回收試劑盒、抗鼠單抗羊抗體購自Thermo公司；HuSOD1鼠單克隆抗體購自北京義翹神州科技有限公司；超濾離心管購自Millipore公司；MBP鼠單克隆抗體購自Proteintech公司；Eazysee Western印跡試劑盒購自北京全式金生物科技有限公司；MBP預(yù)裝柱購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 HuSOD1表達載體的構(gòu)建

根據(jù)GenBank公布的HuSOD1基因序列（序列號EF151142），由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成HuSOD1基因；以合成基因為模板，采用上游引物（5′-CCCATATGGCGACGAAGGCCG-3′）和下 游 引 物（5′-CGGAATTCTTATTGGGCGATCCCA ATTACAC-3′），PCR擴增目的基因（反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30℃，30個循環(huán)；72℃終延伸10 min）；擴增產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳分析，切取目的基因，用膠回收試劑盒回收；目的基因和pMAL-p5x質(zhì)粒分別用NdeⅠ、EcoRⅠ于37℃雙酶切3 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，用T4DNA連接酶于16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，活化后涂布于含氨芐西林（Amp）的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜；挑取單菌落至LB（含Amp）液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后進行菌液PCR鑒定，選取陽性克隆送華大公司測序。

1.3 MBP-HuSOD1融合蛋白的誘導(dǎo)表達及活性檢測

將重組質(zhì)粒pMAL-p5x-HuSOD1、載體pMAL-p5x分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，活化后涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜；挑取單菌落于含Amp的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)過夜；取50 μL菌液于5 mL LB（含Amp）液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌液D600nm約為1.0時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，37℃誘導(dǎo)表達3 h；取1 mL誘導(dǎo)后的菌液，12 000 r/min離心收集菌體，用500 μL TE裂解液重懸后超聲波裂解；分別取全菌裂解液、裂解液上清、裂解液沉淀，加入6×SDS上樣緩沖液，煮沸8 min后進行12.5% 的SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色1 h，脫色液脫色過夜，經(jīng)凝膠掃描后分析蛋白表達水平和形式；取超聲波裂解液稀釋至1/20，以轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒的裂解液為對照，采用氯化硝基四氮唑藍（NBT）光化還原法[12]測定SOD活力。

1.4 MBP-HuSOD1融合蛋白的純化

將活化的菌液以1% 的比例擴大培養(yǎng)于200 mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，12 000 r/min離心收集菌體，用10 mL PBS緩沖液重懸菌體，超聲波破碎菌體30 min，12 000 r/min離心10 min，收集上清，用麥芽糖結(jié)合預(yù)裝柱純化。經(jīng)結(jié)合緩沖液（含 20 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA，pH7.4）漂洗去除雜蛋白直至洗平基線并收集穿過液，通過洗脫緩沖液（含20 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L 麥芽糖、1 mmol/L EDTA，pH7.4）洗脫并收集目的蛋白。

1.5 MBP-HuSOD1融合蛋白酶切與HuSOD1純化

選用截留相對分子質(zhì)量為10×103的超濾離心管將MBP-HuSOD1融合蛋白濃縮至1 mg/mL（采用BCA法測定目的蛋白濃度），100 μL目的蛋白用5 μL因子Ⅹa于25℃酶切，分別在酶切2、4、8、24 h 時從體系中取出 5 μL，加入 5 μL 2×蛋白上樣緩沖液，SDS-PAGE分析。用分子篩層析分離因子Ⅹa酶切產(chǎn)物，收集目的蛋白進行Western印跡。

2 結(jié)果

2.1 pMAL-p5x-HuSOD1表達載體的構(gòu)建

PCR擴增HuSOD1基因，經(jīng)凝膠電泳分析獲得片段大小約為465 bp，與預(yù)期相符（圖1A）。將目的片段與pMAL-p5x重組后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單菌落進行菌落PCR鑒定，目的條帶大小與陽性對照條帶相同（圖1B）。陽性轉(zhuǎn)化子活化后送華大公司測序，測序結(jié)果與目的基因進行比對，顯示基因序列一致（序列略），說明重組質(zhì)粒pMAL-p5x-HuSOD1構(gòu)建成功。

圖1 HuSOD1基因擴增（A）及pMAL-p5x-HuSOD1重組載體的PCR鑒定（B）

2.2 MBP-HuSOD1融合蛋白的表達及活性檢測

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），挑取單菌落于37℃培養(yǎng)至適當(dāng)菌密度時用IPTG誘導(dǎo)3 h，菌體超聲波破碎后進行SDSPAGE分析，結(jié)果顯示有特異性蛋白條帶，該條帶約占全菌蛋白的30% ，且大小與目的蛋白理論相對分子質(zhì)量一致，約為56×103（圖2A）。全菌樣品分別以MBP、HuSOD1鼠單抗為一抗進行Western印跡分析，結(jié)果顯示2條特異性條帶，大小與理論值一致（圖2B）。上述結(jié)果表明MBP-HuSOD1融合蛋白在大腸桿菌中獲得表達，表達量約占全菌蛋白的30% ，其中可溶性蛋白占目的蛋白的63% 。

圖2 MBP-HuSOD1誘導(dǎo)表達的SDS-PAGE（A）及Western印跡（B）

將菌體破碎樣品稀釋至1/20，采用NBT光化還原法測定SOD活性，以轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒的全菌破碎樣品為空白對照，全菌破碎樣品對NBT光化還原反應(yīng)的抑制率隨酶液量的增加而增加（表1），表明轉(zhuǎn)化pMAL-p5x-HuSOD1的全菌破碎樣品具有SOD活性。

表1 SOD活性分析

2.3 MBP-HuSOD1融合蛋白的純化

將誘導(dǎo)表達后的重組菌菌體超聲波破碎，取上清，通過MBP親和層析柱純化，收集穿過和洗脫的蛋白進行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖3。與對照菌裂解液相比，洗脫液樣品在相對分子質(zhì)量約56×103處有特異性條帶，與預(yù)期相符，其中第8號樣品特異性蛋白條帶純度大于95% ，表明純化得到純度為95% 的MBP-HuSOD1蛋白。

2.4 MBP-HuSOD1融合蛋白酶切與HuSOD1純化

用因子Ⅹa將MBP-HuSOD1融合蛋白分別酶切2、4、8、24 h后進行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖4。MBP-HuSOD1條帶隨酶切時間的延長逐漸減少，同時在相對分子質(zhì)量約 40×103、16×103處出現(xiàn)蛋白條帶，直至24 h時MBP-HuSOD1蛋白條帶完全不可見，表明24 h時因子Ⅹa將MBP-HuSOD1融合蛋白完全酶切為MBP、HuSOD1。

圖3 MBP-HuSOD1融合蛋白的純化

圖4 融合蛋白MBP-HuSOD1的因子Xa酶切分析

將經(jīng)過24 h酶切的樣品用分子篩層析分離后進行SDS-PAGE、Western印跡分析，結(jié)果顯示蛋白條帶約為16×103，與預(yù)期相同，且純度約為90% ，表明純化得到純度為90% 的HuSOD1蛋白樣品（圖5）。

圖5 HuSOD1蛋白的SDS-PAGE（A）及Western印跡（B）

3 討論

目前，市售SOD主要從牛血清中提取，由于牛血清來源復(fù)雜，存在病原體污染的問題；而從植物中提取SOD的操作復(fù)雜，生產(chǎn)周期長，不利于大量生產(chǎn)，亟待開發(fā)獲取SOD的新方法。利用大腸桿菌生長速度快、表達能力強的優(yōu)點，王嵐等[13]得到了高表達的SOD，但目的蛋白多以包涵體形式存在，包涵體蛋白折疊方式與蛋白的天然構(gòu)象差異顯著，影響蛋白發(fā)揮其生物活性。MBP融合表達技術(shù)有利于提高目的蛋白的表達量和可溶性表達比例[14-15]，本研究采用MBP融合表達系統(tǒng)表達了MBP-HuSOD1，占全菌蛋白的30% ，可溶性表達占目的蛋白的63% ，并進一步純化和酶切得到純度為90% 的HuSOD1蛋白。因此，通過MBP融合表達系統(tǒng)表達HuSOD1具有表達量高、可溶性表達比例高、純化難度低等優(yōu)點。此外，還可以通過繼續(xù)優(yōu)化誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間等條件提高表達量和可溶性表達比例。

綜上所述，我們獲得了MBP-HuSOD1，并純化酶切得到HuSOD1。SOD1已廣泛應(yīng)用于食品、化妝品領(lǐng)域，在抗腫瘤、抗衰老等領(lǐng)域具有臨床應(yīng)用前景，因此本工作具有較大的意義和價值。