郭清江

乙肝是目前全球范圍內(nèi)一個(gè)不容忽視的公共健康問題，患者往往乙肝病毒檢測(cè)呈陽性，病程＞6個(gè)月或發(fā)病日期不明確但有臨床癥狀表現(xiàn)[1]。全世界70%～80%的肝硬化以及肝癌患者是由乙肝發(fā)展而致，相關(guān)死亡人數(shù)則高達(dá)60萬/年，且仍然處于上升態(tài)勢(shì)[2]。由于該病癥為多因素作用所致的感染性疾病，目前已知多種細(xì)胞因子基因多態(tài)性與其相關(guān)，如腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素等[3]。E-選擇素是近年新出現(xiàn)的一種炎癥細(xì)胞因子，其表達(dá)水平的升高將會(huì)介導(dǎo)炎癥以及免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)。當(dāng)E-選擇素基因第2外顯子5′非翻譯區(qū)98位點(diǎn)G發(fā)生突變時(shí)，引發(fā)G98T位點(diǎn)基因多態(tài)性，并對(duì)E-選擇素表達(dá)水平產(chǎn)生直接影響，進(jìn)一步增強(qiáng)后者所致的炎癥反應(yīng)及浸潤(rùn)能力。HBV-DNA載量可反映乙肝病毒的復(fù)制能力[4]。由于炎癥反應(yīng)在乙肝發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色，所以，有理由相信E-選擇素G98T位點(diǎn)基因多態(tài)性與HBV-DNA載量之間存在著某種關(guān)聯(lián)性，本研究對(duì)此進(jìn)行了探討。

1 資料與方法

1.1 病例資料 選取醫(yī)院2016年3月～2017年3月收治的80例乙肝患者作為觀察組，其中男57例，女 23 例；年齡 38～64（50.24±1.16）歲；病程時(shí)間0.5～2.5（1.10±0.12）年；主要癥狀表現(xiàn)：肝區(qū)不適 11例，上腹部疼痛19例，乏力40例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)臨床診斷確診為乙肝者；（2）民族為漢族；（3）同意此次研究方案并簽署知情同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）甲、丙、丁、戊型肝炎者；（2）合并全身嚴(yán)重器質(zhì)性疾病者；（3）混合或重疊感染者。另選同期于本院體檢的80例健康體檢者為對(duì)照組，其中男60例，女20例；年齡 40～65（50.25±1.15）歲。兩組性別、年齡等一般資料比較差異不顯著（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 血液樣本采集 觀察組于住院第2 d上午6:00～8:00，對(duì)照組于體檢當(dāng)天上午6:00～8:00抽取空腹靜脈血5 ml，置于促凝試管中，待血液徹底凝固后，2500 r/min離心10 min，采集血清，置于-20℃中備用。

1.2.2 E-選擇素G98T位點(diǎn)基因多態(tài)性測(cè)定 首先進(jìn)行E-選擇素G98T位點(diǎn)基因DNA提取工作，吸取800 μl紅細(xì)胞裂解液至容量為1.5 ml的離心管之中，取出冷凍的血液樣本并恢復(fù)至室溫狀態(tài)，吸取400 μl樣本至該離心管中倒置，輕彈管壁以促使二者充分混勻。在室溫條件下靜置10～15 min以待紅細(xì)胞徹底裂解。以12 000 r/min離心30 s，去除上清液并留下白細(xì)胞團(tuán)，渦旋振蕩20 s后重懸處理，加入250 μl細(xì)胞核裂解液后用力吹打數(shù)次以促使白細(xì)胞充分裂解[5]。顛倒離心管10數(shù)次后加入100 μl蛋白沉淀液，渦旋振蕩 30 s，以 13 000 r/min離心10 min，取一支無菌干凈同規(guī)格的離心管，吸取上清液500 μl后置入該管，加入200 μl異丙醇（室溫），適度用力混勻后以12 000 r/min離心60 s并去除上清液[6]。向其加入0.5 ml的70%乙醇，反復(fù)顛倒數(shù)次后漂洗處理以促使DNA沉淀，再次以相同轉(zhuǎn)速離心60 s，去除上清液，殘余乙醇自然風(fēng)干。向由DNA提取的沉淀物之中加入100 μl溶解液，促使其重新水化后輕彈離心管壁以促使其混勻，于65℃孵育0.5～1 h[7]。最后利用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DCA提取液進(jìn)行定型鑒定，具體步驟如下：取10 ml溶液后加入上樣緩沖液1 ml，適度用力混勻后置于電泳儀內(nèi)，電壓為130 V，待0.5 h后去除，并在凝膠成像儀下觀察鑒定結(jié)果[8]。

1.2.3 E-選擇素G98T位點(diǎn)基因組擴(kuò)增 E-選擇素G98T位點(diǎn)基因上下游引物的合成由上海生工生物有限公司完成，擴(kuò)增條件設(shè)定為94℃預(yù)變性600 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s、35 個(gè)循環(huán)，完畢后 72 ℃延伸600 s，5℃下終止反應(yīng)并保存，利用2%瓊脂糖凝膠電泳顯示結(jié)果[9]。隨后于37℃下孵育10 h并進(jìn)行限制性酶切處理，130 V電泳0.5 h，凝膠成像儀下鑒定基因型（AA型、AC型）。

1.2.4 HBV-DNA載量分析 利用豪夫邁.羅氏公司生產(chǎn)的Lightcycler 480熒光定量PCR儀對(duì)HBVDNA載量進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)試劑盒由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供。

1.3 觀察指標(biāo) 將兩組受試者E-選擇素G98T位點(diǎn)基因型與基因頻率、觀察組內(nèi)不同基因型HBVDNA載量、不同HBV-DNA載量基因型與基因頻率作為觀察指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究中所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用例和百分率表示，行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組E-選擇素G98T位點(diǎn)基因型與基因頻率比較 兩組E-選擇素G98T位點(diǎn)基因型與基因頻率相比較，觀察組AA基因型占比、A等位基因頻率低于對(duì)照組，AC基因型占比、C等位基因頻率高于對(duì)照組（P＜ 0.05），見表 1。

表1 兩組E-選擇素G98T位點(diǎn)基因型與基因頻率比較［n（%）］

2.2 觀察組內(nèi)不同基因型HBV-DNA載量 觀察組內(nèi)AA基因型患者HBV-DNA載量為（1.92±0.28）×103copy/ml，而 AC 基因型為（6.33±0.27）×103copy/ml，二者相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 觀察組內(nèi)不同HBV-DNA載量患者基因型與基因頻率比較 依據(jù)HBV-DNA正常上限值（1×103copy/ml），＜1×103copy/ml者 AA 基因型占比及 A等位基因頻率高于≥1×103copy/ml者，AC基因型占比、C等位基因頻率低于≥1×103copy/ml者（P＜0.05），見表 2。

3 討論

乙肝是目前全球范圍內(nèi)一個(gè)不可回避的公共衛(wèi)生疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界約有三分之一的人群既往或現(xiàn)在存在感染乙型病毒肝炎的血清學(xué)證據(jù)，3.5億人成為乙肝病毒攜帶者，與之相關(guān)的終末期肝病或肝癌致死人數(shù)每年高達(dá)100萬[10]。所以明確其發(fā)病機(jī)制并采取行之有效的干預(yù)措施與遏制乙肝發(fā)病率及病死率的過快增長(zhǎng)成為當(dāng)務(wù)之急[11]?，F(xiàn)有研究指出，炎癥細(xì)胞因子與乙肝的發(fā)生、發(fā)展存在著密切的關(guān)聯(lián)性，而E-選擇素則是目前醫(yī)學(xué)界全新發(fā)現(xiàn)的一種炎性細(xì)胞因子，參與到了多種白細(xì)胞以及T淋巴細(xì)胞亞群的黏附與凝集，促使二者相互作用[12]。Lucio Boglione等[13]在其研究中證實(shí)，E-選擇素表達(dá)水平的改變預(yù)示著細(xì)胞表明成分的翻轉(zhuǎn)以及蛋白質(zhì)的水解，在疾病早期活動(dòng)之中發(fā)揮了至關(guān)重要的促進(jìn)作用。尤其是隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，E-選擇素基因多態(tài)性日益受到醫(yī)學(xué)界的重視與關(guān)注。G98T位點(diǎn)基因多態(tài)性為E-選擇素基因第2外顯子5′非翻譯區(qū)98位點(diǎn)G突變所致，該位點(diǎn)并不會(huì)直接翻譯成蛋白質(zhì)，但卻能夠通過對(duì)基因表達(dá)水平的直接調(diào)控來影響E-選擇素的表達(dá)，使得后者介導(dǎo)的黏附凝集作用大幅增強(qiáng)，最終導(dǎo)致E-選擇素表達(dá)水平上揚(yáng)而引發(fā)炎癥反應(yīng)[14-15]。然而，E-選擇素G98T位點(diǎn)基因多態(tài)性是否與乙肝的發(fā)生、發(fā)展存在相關(guān)性因現(xiàn)有研究較少，目前尚不得而知。所以，圍繞此方面內(nèi)容展開分析無疑具有重要的研究?jī)r(jià)值。

表2 觀察組內(nèi)不同HBV-DNA載量患者基因型與基因頻率比較［n（%）］

本研究通過聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)對(duì)乙肝患者（觀察組）以及健康體檢者（對(duì)照組）E-選擇素G98T位點(diǎn)基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，兩組E-選擇素G98T位點(diǎn)基因型與基因頻率相比較，觀察組AA基因型占比、A等位基因頻率低于對(duì)照組，AC基因型占比、C等位基因頻率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示E-選擇素G98T位點(diǎn)基因多態(tài)性與乙型肝炎病毒感染之間存在著一定的關(guān)聯(lián)性，等位基因C可能為慢性乙型肝炎的重要遺傳易感因素。在HBV-DNA載量比較上，觀察組內(nèi)AA基因型患者HBV-DNA載量為（1.92±0.28）×103copy/ml，而 AC 基因型為（6.33±0.27）×103copy/ml，二者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。依據(jù)HBV-DNA載量，依據(jù)HBV-DNA正常上限值（1×103copy/ml），＜1×103copy/ml AA 基因型占比及 A等位基因頻率高于≥1×103copy/ml者，AC基因型占比、C等位基因頻率低于≥1×103copy/ml者，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示臨床AC位點(diǎn)多態(tài)性可能增強(qiáng)HBV-DNA復(fù)制能力。

綜上所述，E-選擇素G98T位點(diǎn)基因存在多態(tài)性，AC位點(diǎn)多態(tài)性可能增強(qiáng)HBV-DNA復(fù)制能力。