郭杉杉 章浙忠 駱 豐 陳 琳★

研究發(fā)現(xiàn)，全世界惡性腫瘤發(fā)病率和病死率均呈上升態(tài)勢，已成為嚴重威脅人類生命和社會發(fā)展的重大公共衛(wèi)生問題，在中國發(fā)病率居前10 位的惡性腫瘤中，胃癌居第二［1］。目前，對胃癌進行合理治療主要采取方式為：對早期胃癌進行微創(chuàng)的內鏡治療，對進展期胃癌進行手術以及放化療等措施［2］。然而手術治療無法徹底根除腫瘤細胞，腫瘤細胞二次復發(fā)率高；同時，放化療有明顯的毒副作用，且易形成耐藥性致其在臨床上的應用受到限制。冬凌草為唇形科香茶菜屬植物，味苦、性寒，具有消炎止痛、清熱解毒以及抗腫瘤的功效［3］。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，從冬凌草中提取的冬凌草甲素（Oridonin，Ori）是抗消化道腫瘤的主要活性成分，其作用機制是通過影響一些腫瘤細胞炎癥因子的分泌，實現(xiàn)抗腫瘤的功效［4］。本研究中，作者以體外培養(yǎng)的人胃癌Sgc-7901細胞和中草藥冬凌草甲素作為研究對象，然后將冬凌草甲素作用于細胞，從細胞分子、蛋白水平通過多種實驗方法探討冬凌草甲素對細胞炎癥因子、基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達的影響，初步探討冬凌草甲素促使胃癌細胞凋亡的作用機制，為研究抗胃癌中藥提供新的實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 人胃癌Sgc-7901細胞購自中科院上海細胞研究所。

1.2 試劑與儀器 冬凌草甲素（HPLC≥98%）（TAUTO BIOTECH），RPMI 1640培養(yǎng)液（浙江吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司），0.25%胰蛋白酶（含EDTA）（浙江吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司），無支原體胎牛血清（FBS）（浙江天杭生物科技有限公司），二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司），Cell Counting Kit-8、RIPA裂解液（強）、PMSF、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、電泳液、蛋白上樣緩沖液（5X）、Western轉膜液、一抗稀釋液、二抗稀釋液（碧云天生物技術研究所），IL33 I抗（M266）（Santa Cruz Biotechnology公 司 ），Anti-IL 1 beta antibody［3E1］（美國abcam公司），Anti-beta-Actin Monoclonal Antibody、Goat anti-Mouse IgG（HRP Conjugate）、Goat anti-Rabbit IgG（HRP Conjugate）、BCA法蛋白定量試劑盒（50T/250T）、Potent ECL高敏化學發(fā)光試劑盒、Prestained Protein Marker（10～170Kda）（杭州聯(lián)科生物公司），RevertAid first strnd cDNA synthesis kit（美國 Thermo 公司），DAPI（10mg）（羅氏公司），人細胞因子磁珠面板（美國 EMD Millipore公司），免疫組化染色試劑盒（北京博奧森公司），增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒（Tiangen公司）等。酶標儀（美國Dynatech公司，型號MR-4100），伯樂SDS-PAGE電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司，型號PowerPacTMHC），全自動化學發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司型號，Tanon-5200 Multi），Luminex 200 液相懸浮芯片系統(tǒng)（美國Luminex 公司，型號LX10009118401），普通PCR擴增儀（美國Bio-Rad公司，型號BS97MyCycler），熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司，型號Bio-Rad iQ5）等。

1.3 方法 （1）Sgc-7901細胞的培養(yǎng)：人胃癌細胞株Sgc-7901為貼壁生長，采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液消化法37℃、5% CO2常規(guī)培養(yǎng)。當細胞匯合度達80%～90%后可進行傳代培養(yǎng)。（2）CCK-8法檢測冬凌草甲素抑制Sgc-7901細胞增殖實驗：將生長狀態(tài)良好的細胞傳代培養(yǎng)于96孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24h后，加入濃度分別為0、16、32、64、128μM的冬凌草甲素培養(yǎng)液各100μl，并設立調零孔，每組設5個重復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加10μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，用酶標儀在570nm處測定OD值。（3）RT-PCR法檢測冬凌草甲素對Sgc-7901細胞中MMP-2和MMP-9表達的影響：收集前述方法培養(yǎng)的并處理的細胞，實驗分組為：空白對照組（0μm），冬凌草甲素實驗組（66.88μm），分別繼續(xù)培養(yǎng)12h、24h和36h。TRIzol法提取細胞總RNA，所得沉淀用15～30μl的超純水溶解沉淀，測OD值后在PT-PCR儀上根據(jù)說明書要求檢測。PCR反應體系按照試劑配制說明配置以β-actin為內參，所有引物序列見表1。以β-actin為內參，數(shù)據(jù)分析結果以2-△△CT表示。（4）Western Blot檢測冬凌草甲素對Sgc-7901細胞IL-33和IL-1β蛋白表達的影響：收集前述方法培養(yǎng)并處理的細胞，實驗分組為：空白對照組（0μm），冬凌草甲素實驗組（66.88μm），分別繼續(xù)培養(yǎng)12h、24h和36h。用80～120μl RIPA裂解液（含1mM的PMSF）裂解30min，4℃、12000r/min離心30min，取上清液，進行Western Blot檢測，最后加ECL顯色液，顯影2min，用化學發(fā)光自顯影進行顯色曝光，內參用β-actin，計算灰度值，對比分析各實驗組間蛋白表達的差異情況，獨立重復三次實驗。（5）免疫細胞熒光法檢測冬凌草甲素對Sgc-7901細胞核因子IL-33表達的影響：收集前述方法培養(yǎng)并處理的細胞，實驗分組為：空白對照組（0μm），冬凌草甲素實驗組（66.88μm），每組3個復孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)24h。棄培養(yǎng)液，1×PBS洗3次，每次5min。加冰丙酮室溫固定30min，1×PBS洗3次，每次5min。5%BSA室溫封閉30 min，1×PBS緩沖液洗3次，每次5min。IL-33I抗4℃冰箱孵育過夜，次日用1×PBS緩沖液洗3次，每次時間5min。FITC標記的Ⅱ抗37℃閉光孵育1h，1×PBS緩沖液洗3次，每次5min。新配的DAPI染料染核1min，1×PBS緩沖液洗3次，每次5min，拍片，以熒光強度表示IL-33的表達水平。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 冬凌草甲素對Sgc-7901細胞增殖的抑制作用 冬凌草甲素作用24h后，采用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖能力。冬凌草甲素對Sgc-7901細胞具有明顯的增殖抑制作用，細胞存活率隨冬凌草甲素作用劑量的增加而降低，表現(xiàn)出一定的劑量-效應關系，其IC50值為66.88μm，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 冬凌草甲素對Sgc-7901細胞中MMP-2和MMP-9表達的影響 MMP-2和MMP-9在一些與炎癥相關的腫瘤中表達活躍，炎癥早期釋放IL-1β和TNF-α等因子可促進MMP-2和MMP-9的過表達。通過抑制IL-1β和TNF-α等炎癥因子，從而下調MMP-2和MMP-9的表達，達到抑制腫瘤侵襲及轉移的目的。RT-PCR顯示，66.88μm冬凌草甲素作用于Sgc-7901細胞24h后，MMP-2和MMP-9表達水平均較空白對照組明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖1。

圖1 冬凌草甲素對Sgc-7901細胞中MMP-2和MMP-9表達的影響

2.3 冬凌草甲素對Sgc-7901細胞IL-33和IL-1β蛋白表達的影響 在本實驗中，采用了Western Blot方法檢測Sgc-7901細胞中IL-1β和IL-33分泌水平的改變。與空白對照組比較，66.88μm冬凌草甲素作用于Sgc-7901細胞12h和24h后，細胞中IL-1β和IL-33的表達均顯著下調，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖2。

圖2 冬凌草甲素對Sgc-7901細胞IL-1β和IL-33分泌水平的影響

2.4 冬凌草甲素對Sgc-7901細胞核轉錄因子IL-33表達的影響 IL-33與IL-1β不同，IL-33在細胞基質中有表達，同時又作為核結合因子定位于細胞核內。通過免疫熒光染色顯示：DAPI染色后，空白對照組胞質的藍色熒光強度明顯高于冬凌草甲素實驗組；FITC染色后，空白對照組胞核的綠色熒光強度明顯高于冬凌草甲素實驗組。與空白對照組比較，冬凌草甲素組IL-33的表達量顯著性下降。見圖3。

圖3 免疫細胞熒光法檢測冬凌草甲素作用24h后的Sgc-7901細胞核因子IL-33的表達

3 討論

本研究中所采用的冬凌草甲素是中藥冬凌草中分離提取的有用活性成分，不良反應低。研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素在體外作用人類腫瘤細胞時，能明顯抑制腫瘤細胞的生長，促進腫瘤細胞的凋亡［5］，鄭配國等［6］發(fā)現(xiàn)其在免疫調節(jié)方面也具有一定作用，胡雪梅等［7］發(fā)現(xiàn)其可抑制高糖高脂誘導的炎癥反應，增加TAp63、Sirtl、Bcl-2的表達和降低p-ERK的表達。在肝癌細胞和巨噬細胞內，冬凌草甲素可通過抑制NF-kB的激活從而抑制iNOS和COX-2的表達。腫瘤細胞無限增殖的能力是其致病的根本因素，抑制腫瘤增殖能力是衡量抗腫瘤藥物療效的重要因素。本實驗采用不同濃度冬凌草甲素作用于胃癌Sgc-7901細胞，CCK-8法測定細胞增殖抑制效率，結果顯示冬凌草甲素對腫瘤細胞有明顯增殖抑制作用，細胞存活率隨冬凌草甲素作用劑量的增加而降低，因此兩者表現(xiàn)出一定的劑量-效應關系，IC50值為66.88μm。

IL-1β不僅是促炎細胞因子，而且可強抑制胃酸的分泌，與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關。L-33具有雙重作用，既可作為分泌細胞因子參與調節(jié)Th2型機體免疫和炎癥反應，又可作為核結合因子定位于細胞核內，對轉錄起抑制作用，在炎癥因子刺激下其可在胃腸道中高表達。Western Blot以及免疫細胞熒光法實驗發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素能明顯抑制腫瘤細胞中IL-1β和IL-33的表達，證明冬凌草甲素能夠通過抑制腫瘤細胞相關炎癥因子的表達，改變腫瘤微環(huán)境，影響腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展，最終達到抗腫瘤的目的。

MMPS在體內參與多種生理活動，如胚胎發(fā)育，組織創(chuàng)面愈合和血管形成等，也可見于一些炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展。研究證明IL-1β和TNF-α能夠促進MMP-2和MMP-9的表達［8］。MMP-2和MMP-9的作用機制是溶解細胞外基質，破壞細胞基膜，給腫瘤細胞突破基膜，發(fā)生轉移創(chuàng)造機會。因此，通過抑制IL-1β和TNF-α等炎性因子的產生，可以有效下調腫瘤細胞中MMP-2和MMP-9的表達，進而抑制腫瘤細胞的浸潤以及轉移。通過RT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素作用后，胃癌細胞的MMP-2和MMP-9的表達明顯下調，說明冬凌草甲素抑制腫瘤細胞侵襲以及轉移的原因之一可能是通過抑制胃癌細胞中相關炎癥因子的表達，從而減少MMP-2和MMP-9的轉錄表達。