洪博 劉軍 張杰 徐天嬌 王玉春 李文靜

中圖分類號 R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）17-2373-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.17.16

摘 要 目的：建立甘遂半夏湯的指紋圖譜，為完善其質(zhì)量控制提供參考。方法：采用超高效液相色譜-二極管陣列檢測器（UPLC-DAD）法建立13批甘遂半夏湯的指紋圖譜，色譜柱為Waters Acquity UPLC HSS T3，流動相為0.1%甲酸-乙腈（梯度洗脫），流速為0.5 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為4 μL。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2004A版）對指紋圖譜進(jìn)行評價(jià)，并采用SPSS 13.0軟件對各樣品進(jìn)行聚類分析。結(jié)果：方法學(xué)考察中，各色譜峰的保留時(shí)間和相對峰面積的RSD均小于2%（n=6）。13批甘遂半夏湯指紋圖譜的相似度均大于0.95，確定了21個共有色譜峰，并指認(rèn)了其中芍藥苷、甘草苷及甘草酸3個共有色譜峰。聚類分析結(jié)果顯示，甘遂半夏湯樣品分為2類。結(jié)論：建立的UPLC-DAD指紋圖譜體現(xiàn)了甘遂半夏湯組分的整體特征，為甘遂半夏湯制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了可靠依據(jù)。

關(guān)鍵詞 甘遂半夏湯；超高效液相色譜-二極管陣列檢測器法；指紋圖譜；質(zhì)量控制

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the fingerprints of Gansui banxia decoction， and to provide reference for improving quality control. METHODS： UPLC-DAD was used to establish the fingerprints of 13 batches of Gansui banxia decoction. The determination was performed on Waters Acquity UPLC HSS T3 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid- acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 0.5 mL/min. The detection wavelength was set at 254 nm， and column temperature was 35 ℃. The sample size was 4 μL. Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （2004A edition） was used to evaluate the fingerprints. SPSS 13.0 software was used for cluster analysis of those samples. RESULTS： In the methodology validation， RSDs of retention time and relative peak area were all lower than 2% for each peak （n=6）. The similarity of fingerprints for 13 batches of Gansui banxia decoction was higher than 0.95； 21 common chromatographic peaks were marked， and 3 common chromatographic peaks of paeoniflorin， liquiritin， glycyrrhizic acid were identified. The results of cluster analysis indicated that Gansui banxia decoction samples were classified into 2 classes. CONCLUSIONS： The established UPLC-DAD fingerprint shows the overall characteristics of components in Gansui banxia decoction. It provides reliable evidence for the establishment of quality standard for Gansui banxia decoction.

KEYWORDS Gansui banxia decoction； UPLC-DAD； Fingerprint； Quality control

甘遂半夏湯收載于《金匱要略·痰飲咳嗽病脈證并治》，有攻逐水飲、潔凈腸腑之功效[1]。甘遂半夏湯由甘遂、半夏、芍藥、甘草組成，方中甘遂為君，降逆，攻逐飲邪，善行腸間經(jīng)隧之飲邪；半夏為臣，醒脾燥濕，化飲降逆，宣暢氣機(jī)；芍藥補(bǔ)血益陰緩急，甘草益氣和中，同為佐[2-3]。雖然本方中甘遂藥性峻猛，有一定毒性，加之與甘草配伍的“十八反”禁忌，但其仍有廣泛的臨床應(yīng)用，主要用于治療（結(jié)核性）胸膜炎、肝硬化腹水、腎積水、肺源性心臟病腹水、慢性腹瀉等[4-7]?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)也表明，該方對實(shí)驗(yàn)性大鼠心包積液、尿毒癥、腎積水、肝硬化腹水、肝癌、高血糖及甲狀腺功能紊亂等都有一定的改善作用[8-12]。

近年來，關(guān)于甘遂半夏湯的研究多集中在藥理作用及臨床應(yīng)用方面，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究鮮有報(bào)道。對本方中的甘遂、半夏、芍藥、甘草單味藥材的指紋圖譜已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道[13-16]，但目前未見甘遂半夏湯指紋圖譜研究的相關(guān)報(bào)道。為了進(jìn)一步完善我國有效方劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究以經(jīng)典名方甘遂半夏湯為研究對象，建立超高效液相色譜-二極管陣列檢測器（UPLC-DAD）指紋圖譜，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供一定參考。

1 材料

1.1 儀器

Acquity UPLC-H-Class高效液相色譜（HPLC）儀，包括四元泵洗脫系統(tǒng)、自動進(jìn)樣系統(tǒng)、柱溫箱及DAD（美國Waters公司）；BSA224S-CW高分辨電子天平（德國Sartorius公司）；5417R臺式高速離心機(jī)（德國Eppendorf科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

13批藥材分別購自齊齊哈爾新藥特藥大藥房（標(biāo)記為S1，批號：20160221；S13，批號：20160311）、齊泰藥店（標(biāo)記為S2，批號：20151218；標(biāo)記為S3，批號：20151129；標(biāo)記為S4，批號：20160923；標(biāo)記為S5，批號：20161211；標(biāo)記為S6，批號：20160823）、齊市建華區(qū)鴻福大藥房（標(biāo)記為S7，批號：20160923）、齊齊哈爾市鶴城中藥批發(fā)站卜奎藥店（標(biāo)記為S8，批號：20170223；標(biāo)記為S9，批號：20171129；標(biāo)記為S10，批號：20161117；標(biāo)記為S11，批號：20171202）和齊齊哈爾康盈國藥堂中藥店（標(biāo)記為S12，批號：20161214），所購藥材經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥教研室主任郭麗娜教授鑒定均為真品，符合2015年版《中國藥典》（一部）藥材標(biāo)準(zhǔn)的有關(guān)規(guī)定，并留樣于齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥材標(biāo)本室；芍藥苷對照品（批號：160524，純度：99%）、甘草苷對照品（批號：161201，純度：98.5%）及甘草酸對照品（批號：160602，純度：98.5%）均購自上海博頓生物化工有限公司；甲醇、乙腈（美國Fisher公司，色譜級）；甲酸（美國Tedta公司，色譜級）；無水乙醇（濟(jì)南世紀(jì)通達(dá)化工有限公司，分析純）；水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC HSS T3（100 mm ×2.1 mm，1.8 μm），預(yù)柱為Waters Acquity UPLC HSS T3（5 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：A為0.1%甲酸，流動相B為乙腈，梯度洗脫（0～2 min，90%～80%A；2～5 min，80%～60%A； 5～10 min，60%～45%A； 10～15 min，45%～0%A； 15～16 min，0%A）；流速：0.5 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：4 μL。

2.2 供試品溶液的制備

按照《金匱要略》甘遂半夏湯處方比例，精密稱取甘遂0.3 g、半夏0.9 g、芍藥1.5 g、甘草0.6 g，置于同一圓底燒瓶中，加入70%乙醇60 mL回流提取2次，每次1 h，抽濾，合并2次濾液，濃縮至60 mL，稱質(zhì)量；將濾液放至室溫后再次稱質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量。然后將濾液以17 217×g離心5 min，收集上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 混合對照品溶液的制備

精密稱取芍藥苷、甘草苷和甘草酸對照品適量，置于同一5 mL棕色瓶中，乙腈溶解并定容至刻度，制備成每mL含芍藥苷400 μg、甘草苷510 μg 和甘草酸620 μg的混合對照品溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 取“2.2”項(xiàng)下供試品（S1）溶液、 “2.3”項(xiàng)下混合對照品溶液，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜。結(jié)果，供試品溶液色譜圖中的芍藥苷、甘草苷和甘草酸的測定與其他成分不存在明顯的干擾，表明本方法對甘遂半夏湯中指認(rèn)成分的檢出具有較好的專屬性。

2.4.2 精密度 取同一供試品（S1）溶液4 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜。以甘草酸的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算各色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，各色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD均小于2%（n=6），表明儀器的精密度良好，符合指紋圖譜的要求。

2.4.3 穩(wěn)定性 取同一供試品（S1）溶液，分別于制備后的0、2、4、6、8、10、12、24 h，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜。以甘草酸的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算各色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，各色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD均小于2%（n=8），表明樣品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性 取同批次樣品（S1）6份，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜。以甘草酸的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算各色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，各色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD均小于2%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的建立及相似度評價(jià)

取13批藥材，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，并以混合對照品溶液進(jìn)樣進(jìn)行色譜峰的定位。然后將13批色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2004A版）版，以樣品S1的圖譜為參照圖譜R，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.5 min，自動匹配生成13批樣品的指紋圖譜；并以樣品S1的圖譜為參照圖譜，采用自動匹配模式進(jìn)行相似度評價(jià)。供試品（S1）溶液與混合對照品溶液的典型色譜見圖1，13批樣品的指紋圖譜見圖2，相似度評價(jià)結(jié)果見表1。

結(jié)果顯示，13批樣品色譜圖的相似度均大于0.95。共得到21個共有色譜峰，并指認(rèn)了其中的3個共有色譜峰：2號共有色譜峰為芍藥苷、4號共有色譜峰為甘草苷和11號共有色譜峰為甘草酸。

2.6 聚類分析

以共有峰峰面積為變量，運(yùn)用SPSS 13.0軟件對13批樣品進(jìn)行聚類分析，得出樹狀圖。聚類譜系中，當(dāng)判別條件距離di=10時(shí)，將13批樣品分為3類：S2、S3、S4、S5、S6、S8、S9、S10、S11、S12批次樣品聚為一類，S1、S13批次樣品聚為一類，S7批次樣品聚為一類；當(dāng)判別條件距離di=15時(shí)，將13批樣品分為2類：S1、S7、S13批次樣品聚為一類，其余10批次樣品聚為一類。這說明藥材的產(chǎn)地可能不同，由于氣候、生長環(huán)境、采收時(shí)間等因素，會影響藥材中化學(xué)成分的含量，造成藥材質(zhì)量的差別較大，影響由各個藥材組成的中藥復(fù)方甘遂半夏湯中化學(xué)成分的含量差別，最終影響該方藥效的發(fā)揮。13批甘遂半夏湯的聚類樹狀圖見圖3。

3 討論

特征中藥指紋圖譜是中藥質(zhì)量控制的有效途徑，是保證中藥安全、有效的重要環(huán)節(jié)，為中藥質(zhì)量評價(jià)提供了新思路和新方法。本研究共標(biāo)定了21個共有色譜峰，并指認(rèn)了其中3個共有色譜峰。13批樣品的指紋圖譜相似度均大于0.95，說明不同來源或批次甘遂半夏湯的化學(xué)組成的一致性較好，這為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也為我國經(jīng)典名方的現(xiàn)代化研究和開發(fā)提供了一種新思路。

3.1 色譜方法的選擇

在前期研究中，筆者分別采用了HPLC法和UPLC法進(jìn)行甘遂半夏湯指紋圖譜的建立分析，發(fā)現(xiàn)HPLC法分析時(shí)間較UPLC法更長，且甘遂半夏湯中的各成分的色譜峰有拖尾的現(xiàn)象，而采用UPLC法分析后，色譜峰峰形較好，分析效率更高，可顯著縮短分析時(shí)間以及減少流動相的消耗，故在本研究中采用UPLC法進(jìn)行指紋圖譜的構(gòu)建。

3.2 流動相的選擇

在前期研究中，筆者分別對甲醇-水、乙腈-水、0.1%甲酸-乙腈、0.1%甲酸-水和0.1%磷酸-水等流動相組成進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，以0.1%甲酸-乙腈為流動相系統(tǒng)時(shí)分離效果最佳，各峰間分離度和峰形均更好，保留時(shí)間也合適。因此，本研究選擇0.1%甲酸-乙腈為流動相體系進(jìn)行梯度洗脫。

3.3 檢測波長的選擇

筆者采用DAD在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，并參考甘遂、半夏、芍藥及甘草的檢測波長，發(fā)現(xiàn)供試品在254 nm波長處出峰數(shù)最多，各峰間分離度良好，特征峰明顯且峰形較好，能較好地反映甘遂半夏湯的整體化學(xué)形態(tài)及色譜保留行為，故在本研究中選定254 nm為檢測波長。

3.4 樣品提取溶劑的選擇

本研究選用70%乙醇為溶劑進(jìn)行樣品提取，是因?yàn)橐掖嫉娜芙庑阅茌^好，對中草藥細(xì)胞的穿透能力較強(qiáng)，用乙醇提取比用水提取的用量更少，且提取時(shí)間較短，溶解出的水溶性雜質(zhì)也少。乙醇雖為有機(jī)溶劑但毒性小，可反復(fù)回收使用，而且乙醇提取液不易發(fā)霉變質(zhì)，所以用乙醇提取也是中藥材成分分析樣品處理的常用方法之一。

本研究的目的主要是建立甘遂半夏湯的指紋圖譜，為甘遂半夏湯的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)，所以用乙醇提取更利于分析甘遂半夏湯的主要成分及對其質(zhì)量進(jìn)行分類分析。但不足之處是未對甘遂半夏湯的水煎劑進(jìn)行分析，后者的分析結(jié)果更適合指導(dǎo)臨床用藥，故本課題組接下來的研究重點(diǎn)將是在本研究基礎(chǔ)上針對甘遂半夏湯水煎液進(jìn)行成分分析。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 張仲景.金匱要略[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：49.

[ 2 ] 王付.學(xué)用甘遂半夏湯方證的思考與探索[J].中醫(yī)藥通報(bào)，2015，14（1）：14-16.

[ 3 ] 程力敏，李景凡.甘遂半夏湯方證芻議[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，1987，13（5）：33-34.

[ 4 ] 趙桐，鐘贛生，張建美，等.含甘遂-甘草反藥組合的甘遂半夏湯臨床用藥分析[J].中國臨床醫(yī)生雜志，2014，42（12）：89-91.

[ 5 ] 劉賓，孫寧，王付.甘遂半夏湯的臨床應(yīng)用[J].河南中醫(yī)，2014，34（12）：2297-2298.

[ 6 ] 陳銳.甘遂半夏湯臨床新用[J].中國社區(qū)醫(yī)師，2011，13（24）：28-29.

[ 7 ] 劉超.甘遂半夏湯治療痰飲久瀉1例[J].中國社區(qū)醫(yī)師，2010，12（27）：150-152.

[ 8 ] 王茜，鐘贛生，王宏蕾，等.甘遂半夏湯中甘遂與甘草不同比例配伍對癌性腹水模型大鼠生物效應(yīng)影響的研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（4）：177-181.

[ 9 ] 王付，程秀娟，張大偉，等.甘遂半夏湯對正常大鼠心腎功能及形態(tài)學(xué)的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（8）：155-159.

[10] 王付，程秀娟，王幫民，等.甘遂半夏湯對大鼠肝功能及形態(tài)學(xué)的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（8）：160-164.

[11] 王付，程秀娟，王幫民，等.甘遂半夏湯對大鼠血常規(guī)血糖及甲狀腺形態(tài)的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（8）：165-168.

[12] 王付，張延武，程秀娟，等.甘遂半夏湯對正常大鼠一般情況及心率、腎上腺的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（8）：169-172.

[13] 王磊，李明華，程顯隆，等.甘遂的HPLC指紋圖譜研究及指標(biāo)成分含量測定[J].藥物分析雜志，2014，34（4）：628-631.

[14] 鄭宵蓓，陳科力，尹文仲，等.鄂西高產(chǎn)半夏甾醇類成分的GC指紋圖譜研究[J].中國藥房，2009，20（3）：194-196.

[15] 馬大龍，張曉平，魏寶紅，等.芍藥湯高效液相色譜指紋圖譜的建立[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，22（18）：78-81.

[16] 王青，張亞楠，張偉云，等.烏拉爾甘草的UPLC指紋圖譜研究[J].中國藥房，2018，29（6）：774-777.

（收稿日期：2017-12-26 修回日期：2018-05-20）

（編輯：林 靜）