趙凱， 葛菁華， 王海

(青島蔚藍生物集團有限公司，山東 青島 266101)

植酸酶作為一種高效的飼料添加劑，在動物體內可以幫助其降解植酸鹽，改善磷和其他養(yǎng)分的消化吸收，減少養(yǎng)分排泄，提高磷的利用率，增加養(yǎng)殖戶的經濟效益，同時對降低植酸磷對環(huán)境的污染有重要作用。目前，養(yǎng)殖業(yè)對植酸酶的需求越來越大，同時更加關注其成本。因此，提高植酸酶表達量，降低發(fā)酵成本成為植酸酶研究、生產的當務之急。

畢赤酵母植酸酶發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究已有很多報道。李洪淼等[1]對巴斯德畢赤酵母的高密度發(fā)酵條件進行了實驗，并根據(jù)搖瓶發(fā)酵的優(yōu)化結果進行了補料方式的研究。黃魁英等[2]對植酸酶畢赤酵母基因工程菌PEY-2的發(fā)酵條件進行了研究。郭美錦等[3]對重組畢赤酵母表達工程植酸酶過渡相參數(shù)進行了分析研究。閔兆升等[4]采用單因素試驗和正交試驗考察了不同工藝條件對畢赤酵母工程菌H311產植酸酶的影響。王興吉等[5]對畢赤酵母H工程菌30 L發(fā)酵產植酸酶的發(fā)酵條件及該酶的熱穩(wěn)定性進行了研究。

1 研究方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

重組畢赤酵母基因工程菌(Mut+)，由本公司自行構建，分泌表達植酸酶。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基為酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎鹽(BSM)培養(yǎng)基(用葡萄糖替換甘油)。

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

將保藏菌種接種到50 mL的YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～24 h，再按照10 %接種量接種YPD培養(yǎng)基擴培16～24 h，然后按照8 %接種量接入發(fā)酵罐BSM培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.2 發(fā)酵控制

流加氨水控制pH 4.5，底糖耗盡后通過流加含12 mL/L 微量鹽(PTM1)培養(yǎng)基的60 %的葡萄糖增加濕重，控制相同濕重(180 g/L左右)開始誘導，根據(jù)實驗需求和測量的濕重控制不同比生長速率(μ)0.01 h-1、0.015 h-1、0.02 h-1進行相應的甲醇補料誘導植酸酶表達。每隔8 h或16 h取樣測濕重，然后調節(jié)甲醇補料量為濕重與比生長速率乘積。

1.2.3 分析方法

細胞濕重測定：10 mL發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min后棄上清稱重；植酸酶酶活測定：GB/T 18634—2009飼用植酸酶活性的測定分光光度法[12]。

2 結果與討論

2.1 對照實驗

發(fā)酵液底料中含有30 g/L葡萄糖，葡萄糖耗盡之后DO回升，此時開始流加60 %的葡萄糖直至誘導所需濕重180 g/L(大約發(fā)酵時間24 h時)，之后停止流加葡萄糖，饑餓30 min左右，開始流加甲醇誘導產酶。對照組甲醇流加策略參照Invitrogen畢赤酵母發(fā)酵手冊[13]進行控制，速度從1 g/(L·h)開始，每兩小時提高0.5 g/( L·h)，直到甲醇流加速度為4.5 g/(L·h)時，停止繼續(xù)提高，并以該流速至發(fā)酵結束。

由圖1可知，發(fā)酵40 h時(大約誘導后15 h左右)，濕重186 g/L，酶活691 U/mL，隨后酶活和濕重隨發(fā)酵時間增加，發(fā)酵144 h時濕重出現(xiàn)輕微下降，最后兩個取樣點酶活基本相同，至發(fā)酵168 h時下罐，此時濕重408 g/L，酶活10 282 U/mL。

圖1 對照酶活濕重曲線Fig.1 Enzyme activity and wet cell weight profile of the control group

2.2 比生長速率為0.01 h-1時的產酶狀況

甲醇誘導產酶之前的過程同2.1。甲醇流加速度從1 g/(L·h)開始，按照0.01 h-1乘以相應的濕重(每8 h或16 h取樣測濕重，然后進行相應的甲醇流速調節(jié))所得的速度進行甲醇補料。

由圖2可知，發(fā)酵40 h時，濕重192 g/L，酶活583 U/mL，隨后酶活和濕重隨發(fā)酵時間增加，酶活168 h時出現(xiàn)輕微下降，至發(fā)酵168 h時下罐，此時濕重457 g/L，酶活11 763 U/mL。以0.01 h-1的比生長速率進行甲醇流加，發(fā)酵最終消耗甲醇5.3 L，而對照組甲醇消耗6.2 L，盡管甲醇消耗比對照少14.5 %，但是酶活卻比對照高14.4 %。

圖2 比生長速率0.01 h-1時酶活濕重曲線Fig.2 Enzyme activity and wet cell weight curve at specific growth rate adjusted to 0.01 h-1

2.3 比生長速率為0.015 h-1時的產酶狀況

甲醇誘導產酶之前的過程同2.1。甲醇流加速度從1 g/(L·h)開始，按照0.015 h-1乘以相應的濕重(每8 h或16 h取樣測濕重，然后進行相應的甲醇流速調節(jié))所得的速度進行甲醇補料。

由圖3可知，發(fā)酵40 h時，濕重185 g/L，酶活423 U/mL，隨后酶活和濕重隨發(fā)酵時間增加，144 h時濕重出現(xiàn)下降，至發(fā)酵168 h時下罐，此時濕重482 g/L，酶活13 644 U/mL。以0.01 h-1和0.015 h-1的比生長速率進行甲醇補料，中前期酶活和對照相當甚至比對照低，但是隨著發(fā)酵進行，菌體濕重增大，甲醇流加量增大，最終發(fā)酵酶活都超過對照組。

圖3 比生長速率0.015 h-1時酶活濕重曲線Fig.3 Enzyme activity and wet cell weight curve at specific growth rate adjusted to 0.015 h-1

2.4 比生長速率為0.02 h-1時的產酶狀況

甲醇誘導產酶之前的過程同2.1。甲醇流加速度從1 g/(L·h)開始，之后按照0.02 h-1乘以相應的濕重(每8 h或16 h取樣測濕重，然后進行相應的甲醇流速調節(jié))所得的速度進行甲醇補料。

由圖4可知，發(fā)酵40 h時，濕重190 g/L，酶活712 U/mL，隨后酶活和濕重隨發(fā)酵時間一直增加，至發(fā)酵168 h時下罐，此時濕重524 g/L，酶活17 445 U/mL。以0.02 h-1的比生長速率進行甲醇補料時，酶活一直比對照和其他兩個實驗組高，可以推斷前期菌體適應甲醇后，在一定范圍內，甲醇量越高對產酶越有利。而以0.02 h-1的比生長速率進行甲醇流加，最終酶活比對照提高69.7 %，因此，以合適的比生長速率控制甲醇流加，可能會引起菌體代謝流的改變，更多的代謝能量和物質流向產酶通路。

圖4 比生長速率0.02 h-1時酶活濕重曲線Fig.4 Enzyme activity and wet cell weight curve at specific growth rate adjusted to 0.02 h-1

由圖5可知，隨著底糖消耗DO逐漸降低，至16 h左右，底糖耗盡，DO回升，隨之開始補糖流加，至發(fā)酵24 h左右濕重達到180 g/L，停糖饑餓30 min，此時DO大幅回升，然后按照1 g/(L·h)的速度流加甲醇3 h，之后按照各自甲醇流加策略分別進行甲醇流加。發(fā)酵中期DO水平與甲醇流加量相關，甲醇流加量大，DO水平低，而發(fā)酵后期DO基本都跌零，但是通過對發(fā)酵液進行液相檢測，甲醇幾乎沒有殘留。

圖5 不同比生長速率下的溶氧量曲線Fig.5 Time course of dissolved oxygen at different specific growth rates

3 結論

以不同的比生長速率進行甲醇流加補料，發(fā)酵酶活均比對照提高。以0.01 h-1，0.015 h-1，0.02 h-1比生長速率進行甲醇補料，酶活分別提高14.4 %，32.7 %，69.7 %。以比生長速率指導甲醇補料，既可以提高甲醇的利用率，又可以提高酶活力，從而降低發(fā)酵成本。受取樣時間的限制，本文根據(jù)比生長速率進行甲醇流速調整的時間間隔為8 h或16 h，如果利用可以在線檢測菌體密度的發(fā)酵反應器，根據(jù)測得的菌體密度在線實時反饋調節(jié)甲醇流量，可能會得到更優(yōu)的結果。隨著比生長速率的提高，酶活提高越多，在DO允許的情況下，繼續(xù)提高比生長速率可能會更大地提高產酶量，而受反應器及DO的限制，本文得到的最適比生長速率為0.02 h-1。