楊俊慧，馬恒，滿德恩，郭脈海，劉慶艾，馬耀宏，史建國*

(1.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)，山東省科學院生物研究所，山東省生物傳感器重點實驗室，山東 濟南 250014；2.菱花集團有限公司，山東 濟寧 272032)

凡是能利用葡萄糖或乳糖發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的細菌統(tǒng)稱為乳酸菌[1]，分為18個屬，共有200多種[2]。乳酸菌不僅在理論研究上具有重要的學術價值，是研究分類、生化、遺傳、分子生物學和基因工程的理想材料，在工業(yè)、農(nóng)牧業(yè)、食品和醫(yī)藥等與人類生活密切相關的重要領域應用價值也極高。研究乳酸菌發(fā)酵過程中乳酸[3]、葡萄糖以及細胞數(shù)量等各參數(shù)的變化情況，可以更好地了解乳酸菌的發(fā)酵代謝過程，有利于發(fā)酵過程的調(diào)控。以往研究多局限于利用傳統(tǒng)手段控制過程參數(shù)，如通過分光光度計測量發(fā)酵過程中細胞生長曲線[4]，采用中和滴定法或比色法測定乳酸含量[5]等，對發(fā)酵過程中重要參數(shù)的變化規(guī)律缺乏深入便捷的測試方法。使用現(xiàn)代化在線控制系統(tǒng)實時監(jiān)測乳酸菌發(fā)酵過程，可以為乳酸菌發(fā)酵研究以及實際生產(chǎn)過程中參數(shù)控制問題提供更加準確、便利的方法。

本文使用在線控制系統(tǒng)對乳酸菌發(fā)酵條件進行研究，通過KRH-BI0300型發(fā)酵罐控制系統(tǒng)、細胞密度監(jiān)測系統(tǒng)、SHP8400PM過程氣體質(zhì)譜分析儀、生物傳感分析儀等多種現(xiàn)代化發(fā)酵過程分析手段檢測發(fā)酵過程參數(shù)，準確且方便、快捷地掌握乳酸菌發(fā)酵過程主要指標的變化情況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

乳酸菌L1(山東省科學院生物傳感器重點實驗室保藏)。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)斜面培養(yǎng)基：MC培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術有限公司)。

(2)種子培養(yǎng)基：MRS肉湯培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術有限公司)。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基：10.0 g/L葡萄糖(天津大茂化學試劑廠)；5.0 g/L酵母膏(國藥集團化學試劑有限公司)；5.0 g/L蛋白胨(國藥集團化學試劑有限公司)；2.0 g/L檸檬酸氫二銨(國藥集團化學試劑有限公司);1 mL/L吐溫80(國藥集團化學試劑有限公司)；5.0 g/L乙酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；2.0 g/L磷酸氫二鉀(國藥集團化學試劑有限公司);0.58 g/L硫酸鎂(國藥集團化學試劑有限公司);0.25 g/L硫酸錳(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 實驗儀器

KRH-BI0300型發(fā)酵罐(江蘇科海生物工程設備有限公司)；SHP8400PM過程氣體質(zhì)譜分析儀(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；細胞密度監(jiān)測系統(tǒng)(瑞士哈美頓博納圖斯股份公司)；SBA-40D生物傳感分析儀(山東省科學院生物傳感器重點實驗室)；立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；SW-CJ-2FD雙人單面垂直送風凈化工作臺(浙江蘇凈凈化設備有限公司)；303A電熱恒溫培養(yǎng)箱(南通宏大實驗儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌發(fā)酵實驗

1.3.1.1 菌株培養(yǎng)及保藏

將乳酸菌菌株接種于新鮮斜面培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)24 h，再次進行接種培養(yǎng)24 h，放入4 ℃冰箱保藏，每隔一個月活化一次[6]。

1.3.1.2 種子培養(yǎng)

將乳酸菌菌株按10%接種量接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱25 ℃靜置培養(yǎng)24 h。

1.3.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

將乳酸菌種子液按10%接種量接種于10 L發(fā)酵罐中，攪拌100 r/min，通氣0.5 L/min, 25 ℃培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束。

1.3.2 過程參數(shù)分析方法

1.3.2.1 乳酸菌生長曲線測定

在細胞密度監(jiān)測系統(tǒng)中，使用Incyte活細胞密度電極檢測乳酸菌生長過程中的活細胞數(shù)量變化情況。

1.3.2.2 發(fā)酵過程中pH測定

通過KRH-BIO3000發(fā)酵罐控制系統(tǒng)，使用pH電極檢測發(fā)酵過程中的pH變化。

1.3.2.3 發(fā)酵過程中乳酸、葡萄糖質(zhì)量濃度測定

每隔2 h取樣，利用生物傳感器測定[7]浸泡液中乳酸、葡萄糖的含量，測定時每次為25 μL,響應時間20 s，測定周期小于2 min,誤差小于2%。樣品不需脫色、分離純化就可直接測定。

1.3.2.4 發(fā)酵尾氣成分測定

通過SP8400PM過程氣體質(zhì)譜分析儀分析主要發(fā)酵尾氣成分。

2 結(jié)果與討論

發(fā)酵過程中乳酸菌的生長與乳酸的產(chǎn)生和葡萄糖的消耗密切相關，同時發(fā)酵過程中的pH、溶氧等參數(shù)對發(fā)酵過程也有重要影響。通過發(fā)酵在線控制系統(tǒng)實時檢測發(fā)酵過程中的參數(shù)變化，對乳酸菌發(fā)酵調(diào)控具有重要意義。

2.1 乳酸菌生長曲線測定

在細胞密度監(jiān)測系統(tǒng)中測乳酸菌活細胞數(shù)量,其發(fā)酵過程變化情況如圖1所示。在交變電場中，活細胞相當于微小的電容，而死細胞或細胞碎片不能極化，形不成電容[8-9]。Incyte電極測量這些小容量電容器的電荷，并以介電常數(shù)顯示(pF/cm)。4 h時活細胞介電常數(shù)達到最大值，為0.57 pF/cm，繼續(xù)發(fā)酵，細胞數(shù)量逐漸減少，15 h后逐漸趨于平穩(wěn)。

圖1 乳酸菌活細胞數(shù)量變化曲線Fig.1 The profile of the amount changing of lactic acid bacteria living cells

2.2 發(fā)酵過程中的pH變化情況

發(fā)酵過程中的pH是一個綜合性指標，pH通過影響代謝途徑中酶的活性、細胞膜的滲透性以及培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)分解利用等因素進而影響微生物的生長繁殖和代謝產(chǎn)物的積累[10]。發(fā)酵過程中pH變化情況如圖2所示。發(fā)酵10 h時，乳酸菌生長產(chǎn)生乳酸使pH明顯下降。16 h后pH逐步穩(wěn)定，因為乳酸菌生長進入衰亡期，乳酸產(chǎn)量趨于平穩(wěn)。

圖2 發(fā)酵過程中pH變化曲線Fig 2 The profile of pH changing during fermentation

2.3 發(fā)酵過程中乳酸、葡萄糖質(zhì)量濃度測定

乳酸菌發(fā)酵是一個消耗葡萄糖、生成乳酸的過程，乳酸菌發(fā)酵過程中的葡萄糖、乳酸變化情況見圖3、圖4。如圖3所示，發(fā)酵0～10 h過程中，發(fā)酵液中葡萄糖濃度逐步降低，10 h后葡萄糖濃度基本趨于穩(wěn)定。如圖4所示，0～10 h乳酸濃度逐漸增加，10 h后基本趨于穩(wěn)定。

圖3 發(fā)酵過程中葡萄糖、乳酸變化曲線Fig.3 The profile of glucose and lactic acid changing during fermentation

圖4 發(fā)酵過程中氣體體積分數(shù)變化曲線Fig.4 The profile of gas volume fraction changing during fermentation

2.4 發(fā)酵尾氣成分測定

罐內(nèi)N2、O2、Ar、CO2等主要發(fā)酵尾氣組成體積分數(shù)的變化反映了整個發(fā)酵過程物質(zhì)的變化情況[11]。發(fā)酵過程中尾氣變化情況如圖4所示。CO2的釋放在一定條件下與細胞量成正比，監(jiān)測CO2的生成是跟蹤生長活動的有效方法。O2是構成細胞本身及代謝產(chǎn)物的組分之一，菌體的生長和產(chǎn)物的代謝均需要大量的O2。同時監(jiān)測發(fā)酵罐中N2及Ar體積分數(shù)的變化可以充分了解尾氣中各種組成氣體所占比例，N2、Ar并不參與代謝過程，測定已知流速的進氣空氣和尾氣中的N2、Ar的體積分數(shù)并建立平衡方程，可以消除尾氣流速誤差帶來的影響[12]。隨著發(fā)酵的進行，罐內(nèi)的氣體成分逐漸變化，CO2體積分數(shù)在5 h時開始升高，在7 h達到峰值后開始下降，20 h后逐漸趨于平穩(wěn)；O2體積分數(shù)在5 h時開始下降，10 h后趨于平穩(wěn)；N2體積分數(shù)在5 h時減少至最低點后逐漸增加直至趨于平穩(wěn)，主要是因為罐內(nèi)CO2體積分數(shù)增多，總體積不變的情況下N2占總體積分數(shù)減少，N2與O2體積分數(shù)減少量與CO2體積分數(shù)增加量基本相同。惰性氣體Ar的體積分數(shù)基本不變。

3 結(jié)論

在整個發(fā)酵過程中乳酸菌不斷繁殖，4～5 h乳酸菌活細胞數(shù)量達到最大值，同時發(fā)酵罐內(nèi)乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的CO2體積分數(shù)也達到最大值，O2消耗導致罐內(nèi)O2體積分數(shù)達到最低點。隨著乳酸菌的生長繁殖，產(chǎn)物乳酸的增長時間與培養(yǎng)基中主要成分——葡萄糖的消耗時間基本吻合，說明乳酸菌利用葡萄糖代謝繁殖生成乳酸，乳酸濃度增加的同時引起發(fā)酵過程中的pH變化。分析檢測乳酸菌發(fā)酵過程中的主要參數(shù)，可以準確且方便、快捷地掌握乳酸菌生長繁殖情況，為乳酸菌代謝調(diào)控及其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供條件。