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        分離純化胰島細胞超薄切片的瓊脂預包埋制備方法

        2018-10-19 06:23:30首都醫(yī)科大學100069金良韻姬曼孫竹林
        首都食品與醫(yī)藥 2018年5期
        關鍵詞:小鼠方法

        首都醫(yī)科大學(100069)金良韻 姬曼 孫竹林

        利用電子顯微鏡對樣品進行觀察和研究,不僅要有先進精密的儀器,更要有制備樣品所需的各種技術技巧[1]。由于胰島細胞體積小,分布分散,給電鏡取材造成了困難;而在人類胰島細胞數(shù)量龐大,僅占胰腺總體積的1%~2%,如常規(guī)電鏡取材則費時費力。本研究采用了膠原酶Ⅺ灌注法對小鼠進行取材,避免了取不到胰島細胞的尷尬。同時采用瓊脂預包埋的方法,該方法對樣品進行多次離心沉淀不會損傷樣品超微結構。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物 健康C57/6J雄性小鼠

        1.2 主要儀器設備與試劑 ①超薄切片機(leica UC7),透射電鏡(HITACHI HT7700)。②戊二醛、鋨酸、乙醇、丙酮、Epon812、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛,均購自美國EMS(Electron microscopy science)公司。瓊脂糖為美國Sigma公司產(chǎn)品。膠原酶Ⅺ(#C7657)為美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。

        1.3 方法

        1.3.1 分離、純化胰島細胞團 將小鼠麻醉,打開腹腔充分暴露十二指腸及周邊胰腺,探查膽總管,用動脈夾夾閉靠近十二指腸的乳頭處,經(jīng)膽總管注射2.5mL膠原酶Ⅺ溶液,可見膠原酶沿胰尾順序充盈,再將其胰尾及其他部分完整摘取,放入50mL離心管中,38℃水浴箱消化10min,加入遇冷HBSS緩沖液至40mL停止消化,1400rpm離心1min,棄掉上清液,重復離心3次。加入4℃ Histopaque1077 7mL重懸,再沿離心管管壁緩慢加入4℃DMEM培養(yǎng)基7mL,可見離心管內(nèi)液體分液,2000rpm,離心10min。并緩慢吸出兩液間的胰島移至含有6mLHBSS的細胞培養(yǎng)皿(60mm)中。在體式顯微鏡下,用移液槍挑取完整胰島,將挑取出來的胰島放入另一個含有6mLHBSS的細胞培養(yǎng)皿(60mm)中,手動挑取重懸胰島3次。

        1.3.2 戊二醛預固定 在培養(yǎng)皿中加入預冷的4℃戊二醛3~5mL,固定10min,再將液體移至離心管中,離心1500rmp,10min,棄掉上清,重復加入預冷的戊二醛,放入4℃冰箱固定2h。后去掉上清液,加入0.1MPB緩沖液洗3次,每次10min。待后續(xù)包埋。

        1.3.3 瓊脂預包埋 用0.1MPB緩沖液配制瓊脂,將其配成2%瓊脂溶液,用酒精燈加熱至瓊脂完全溶解,待瓊脂溶液溫度降到43℃,仍然保持溶液狀態(tài)。將胰島細胞離心(1500rpm,5min),吸出離心管中的PB緩沖液,僅留少量緩沖液浸過胰島細胞,待瓊脂溶液溫度降至43℃,向胰島細胞離心管中快速加入適量液態(tài)的2%瓊脂溶液,再加入適量PB,迅速離心(1500rpm,3~5min),胰島細胞呈團狀同瓊脂塊一同沉于離心管底,放入4℃冰箱中凝固。

        1.3.4 鋨酸后固定 用1%鋨酸對其進行后固定,時間以不超過2h為宜。固定后樣品組織呈黑色,將帶有胰島細胞的塊狀瓊脂取出,并向其修整為1mm3的小塊,再放入試管中繼續(xù)后續(xù)步驟。雙蒸水對細胞清洗3次,每次10min。

        1.3.5 脫水、置換、滲透及包埋 分別對其進行50%、70%、90%、100%酒精脫水,每次10min;環(huán)氧丙烷置換2次,每次15min;Epon812樹脂低純度(1∶1)滲透40min室溫,中純度(1∶3)滲透40min室溫,純樹脂滲透40min室溫。包埋聚合35℃5h,60℃5h,70℃9h。

        1.3.6 超薄切片 將聚合完成的樹脂塊在leica UC7徠卡切片機上切成70nm厚度的超薄切片。撈至100目的銅網(wǎng),待紅外線烘干后,醋酸雙氧鈾染色20min,檸檬酸鉛染色2min,蒸餾水沖洗后于透射電鏡(HITACHI HT7700)下觀察。

        2 結果

        超薄電鏡下(透射電鏡HT7700)觀察胰島細胞,核為圓形,核膜清晰完整,核周間隙正常,胞質(zhì)內(nèi)可見結構清晰的線粒體、核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器,另可見較多的內(nèi)分泌顆粒,多數(shù)為胰島B細胞的分泌顆粒,內(nèi)部為胰島素,少數(shù)為其他類型的內(nèi)分泌顆粒,均獲得結構清晰完整的胰島細胞。

        附圖1、附圖2 小鼠胰腺細胞??梢娂毎そ缦耷逦?、細胞核完整、胞漿內(nèi)見大量內(nèi)分泌顆粒。透射電鏡×2000倍、×2500倍。

        附圖3、附圖4 小鼠胰腺細胞。細胞膜結構清晰、可見細胞膜間連接,胞漿內(nèi)見大量內(nèi)分泌顆粒和線粒體。透射電鏡×3000倍、×4000倍。

        3 討論

        要想獲得最終完美的電鏡圖像,每一個步驟都會是其影響因素,因此在制作過程中不能放過任何一個細節(jié)。本實驗的取材采取了膠原酶Ⅺ灌注法,并用瓊脂預包埋的方法,成功地得到了小鼠胰島細胞的透射電鏡樣品,獲得了良好的超微結構。張旭東等[2]利用直接取材法也成功得到了胰島細胞的超薄切片,但本實驗方法的優(yōu)點在于:①制成樹脂包埋塊以后無需半薄定位,直接超薄切片,避免反復定位,更快速,省去時間成本。②直接取材的方法,經(jīng)常定位不準確,取不到有效區(qū)域,則需要重新取樣,反而費時費力。而本實驗可以做到精準取材,高速有效,能夠在有限的觀察視野下,看到更多的胰島細胞。而后利用瓊脂預包埋法,把相對松散又細小的胰島細胞集中在一起,更加提高了超薄切片上的有效區(qū)域,有利于實驗人員更為全面地觀察和判斷胰島細胞的超微結構。本實驗的關鍵不是瓊脂的濃度,而是瓊脂低熔點的特性,在高溫煮沸瓊脂后將溫度降至40℃時,瓊脂仍然為液體狀態(tài),加入后與胰島細胞混合,離心,待溫度降到40℃以下時則瓊脂凝固,此時胰島細胞已經(jīng)離心、團聚至瓊脂最下方。此外,瓊脂的低熔點也避免了細胞內(nèi)超微結構受損。除了瓊脂低熔點的特性以外,膠原酶Ⅺ的濃度和時間也是決定獲取胰島細胞多與少的關鍵因素:如若濃度過低或時間過短,會使胰島尚未完全分離,而外分泌腺則會混入其中;若濃度過高或時間過長,則會破壞胰島包膜,消化過度。

        本實驗方法中需要注意的細節(jié)有:①鋨酸進行后固定以后,帶有瓊脂的胰島細胞會顯色,被氧化成黑色,需要修掉多余的瓊脂塊,最后留少量瓊脂,以便后續(xù)的脫水和滲透。如果瓊脂濃度過高也不利于脫水和滲透。②將瓊脂加入到胰島細胞時的溫度:溫度過高容易燙損細胞,溫度過低容易使瓊脂凝固,無法離心沉淀。

        綜上所述,本實驗通過膠原酶Ⅺ灌注的方法取材,后經(jīng)利用低熔點瓊脂預包埋,成功制備出胰島細胞的超薄切片,可有效獲得數(shù)量較多的并且超微結構不受損傷的胰島細胞結構。在利用膠原酶Ⅺ灌注取材的時候會相對比直接取材相對更費事,但是這種方法可以在制樣后段有效地提高工作效率,并對胰島調(diào)節(jié)血糖的機制提供了可靠而有效的方法。

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