陳海云 廖洪利 杜希利

（喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 新疆 喀什 844000）

腫瘤干細(xì)胞是一群腫瘤中少數(shù)具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞，目前在白血病、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細(xì)胞[1]。miRNA分子在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有獨(dú)特的表達(dá)特征和生物學(xué)功能，miRNA在腫瘤的分子診斷和治療中具有廣發(fā)的應(yīng)用前景[2]。近年來(lái)，研究者構(gòu)建了多項(xiàng)非病毒納米載體，高效的將miRNA或者siRNA入胞，抑制靶基因表達(dá)，達(dá)到治療腫瘤的目的。已有研究證實(shí)[3]miR-425分子在肺癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、食管癌和腎癌等多種腫瘤中發(fā)揮著重要功能，在腫瘤的診斷、治療及預(yù)后中具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

1.資料與方法

1.1 一般資料

人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)；細(xì)胞培養(yǎng)基：DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清；培養(yǎng)箱環(huán)境為：CO25%+37℃ 恒溫箱中養(yǎng)。DMEM培基、Real-Time PCR、購(gòu)買(mǎi)自GIBCO公司；引物在上海生工合成，CD133和CD4抗體購(gòu)自BD公司，PDL1抗體購(gòu)自abcam公司。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自life公司，miR425慢病毒載體購(gòu)自上海吉瑪生物公司。

設(shè)立空白組（PEG納米脂質(zhì)體），對(duì)照組（轉(zhuǎn)染control）和實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染miR425慢病毒載體）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)定量PCR（Real-Time qRT-PCR）

（1）冰上配制反應(yīng)液

表1 Real-Time PCR反應(yīng)體系

配置好后，混合均勻，并瞬時(shí)離心以沉降管內(nèi)所有物質(zhì)于管底。

（2）使用 CFX96 ? Real-Time PCR Detection System 擴(kuò)增儀進(jìn)行mRNA 的Real-time PCR 實(shí)驗(yàn)

表2 Real-Time PCR反應(yīng)程序

熔解曲線分析從 65℃開(kāi)始到95℃停止，間隔 0.5℃。

（3）每個(gè)基因設(shè)置3個(gè)復(fù)空，實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)算△△Ct值，之后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.2 檢測(cè)PDL1表達(dá)水平 HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，裂解，SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，4℃一抗孵育過(guò)夜，1*TBST洗滌3次/5 min，二抗37℃ 孵育1hours，1*TBST洗滌3次/10 min，電化學(xué)（ECL）發(fā)光試劑顯色，X射線膠片壓片后顯影、定影。

1.2.3 CCK8實(shí)驗(yàn)

（1）將調(diào)整細(xì)胞密度為1000～10000/well，每孔加入200μL細(xì)胞懸液。

（2）放置于5%二氧化碳，37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（3）接種細(xì)胞后，到達(dá)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，每孔加CCK8溶液20μL，孵育 4h。

（4）酶標(biāo)儀450nm測(cè)定每個(gè)孔的吸光值。

1.2.4 雙熒光素酶活性測(cè)定

（1）24孔板中接種適量的細(xì)胞，待密度達(dá)到60%～80%轉(zhuǎn)染。PGl3-enhancer報(bào)告載體和pRL-TK載體質(zhì)粒按照10：1的比例混勻，轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

（2）轉(zhuǎn)染48h后，去除細(xì)胞培基，預(yù)冷的1×PBS，輕洗3次去除培養(yǎng)板內(nèi)液體。

（3）用雙蒸水將5×PLB裂解液配置為1×PLB裂解液，100μL/孔1×PLB裂解液，將培養(yǎng)板-80℃冰箱靜置15分鐘，室溫下靜置裂解15分鐘，用移液器吹打細(xì)胞。

（4）每孔加入10μL裂解物，每組3個(gè)復(fù)孔，將96孔板放置于酶標(biāo)檢測(cè)儀，加入LARII底物30μL，測(cè)得Luciferase 熒光素酶活性值。

（5）迅速加入Stop&Glo試劑30μL，測(cè)得pRL-TK海腎熒光素酶的熒光強(qiáng)度。

（6）相對(duì)熒光素酶活性=Luciferase熒光素酶活性值/pRL-TK海腎熒光素酶活性值的比值。

2.結(jié)果

2.1 腫瘤干細(xì)胞的干性

HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，空白組CD133和CD44雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量為（1.16±1.01）%，對(duì)照組細(xì)胞CD133和CD44雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量為（0.99±1.12）%，實(shí)驗(yàn)組CD133和CD44雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量為（0.36±0.88）%，提示過(guò)表達(dá)miR425抑制結(jié)直腸癌干細(xì)胞的自我更新能力。

HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，將20個(gè)單細(xì)胞種植于基質(zhì)膠表面，直至形成肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腫瘤球細(xì)胞數(shù)目為（4±1）、（5±1）和（2±1）。實(shí)驗(yàn)組形成的腫瘤球數(shù)目最少。

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)

CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)空白組活性為（0.62±0.23），對(duì)照組為（0.72±0.13），實(shí)驗(yàn)組為（0.32±0.05），實(shí)驗(yàn)組生長(zhǎng)能力明顯受到抑制。

2.3 蛋白質(zhì)印跡雜交(Western bloting)和Real-Time PCR檢測(cè)miR425和PDL1表達(dá)

HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，Real-Time PCR 檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組的miR-425的相對(duì)表達(dá)水平為（201.4±21.3），對(duì)照組與空白組分別為（2.1±1.23）和（2.4±0.88），實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組與空白組（P＜0.05）。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組PDL1的相對(duì)表達(dá)量為（0.97±0.12）、（0.93±0.22）和（0.34±0.13），實(shí)驗(yàn)組PDL1表達(dá)顯著降低。miR-425的表達(dá)與PDL1表達(dá)成負(fù)相關(guān)。

3.討論

在生物體細(xì)胞中RNA含量豐富，除了mRNA、tRNA和rRNA外，還存在其他的非編碼小RNA，它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)扮演了非常重要的角色，構(gòu)成了細(xì)胞內(nèi)高度復(fù)雜的RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miRNA在生物體的多種調(diào)控過(guò)程中扮演著重要作用例如細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞死亡、細(xì)胞衰老、細(xì)胞分化和器官發(fā)育等過(guò)程。有學(xué)者認(rèn)為結(jié)直腸癌是由一小群未分化、致瘤性CD133細(xì)胞產(chǎn)生和擴(kuò)增的惡性腫瘤，CD133應(yīng)該可以成為將來(lái)臨床治療結(jié)直腸癌的有效靶點(diǎn)[4]。如果腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、和耐藥的根源確實(shí)是由于少量腫瘤干細(xì)胞，納米這就可以解釋目前臨床上惡性腫瘤治療失敗的原因。因?yàn)槟壳芭R床使用的多數(shù)治療方法并不是針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的，所有盡管它們可以使惡性腫瘤體積縮小甚至完全消退，但這些效果通常是短暫的[5]。只要腫瘤干細(xì)胞沒(méi)有被根除，納米剩下的腫瘤干細(xì)胞足以導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的治療戰(zhàn)略可能是根治腫瘤、阻止腫瘤轉(zhuǎn)移和解決腫瘤耐藥的關(guān)鍵。

本文設(shè)立了空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組3組細(xì)胞利用PEG納米脂質(zhì)體包裹的miR-425高效的將miRNA運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)，僅有100nmPEG納米脂質(zhì)體極易穿過(guò)毛細(xì)血管，延長(zhǎng)了腫瘤組織與脂質(zhì)體的接觸時(shí)間，納米脂質(zhì)體在腫瘤組織部位聚集，濃度得到提升，提高了藥物或miRNA對(duì)腫瘤的靶向作用。研究證實(shí)PEG納米脂質(zhì)體能夠延長(zhǎng)脂質(zhì)體在血液循環(huán)中存留時(shí)間，并且能夠高效的將藥物或其他小分子物質(zhì)帶到腫瘤組織部位，提高了藥物的時(shí)效性。

細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-425過(guò)表達(dá)后細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力變化。結(jié)果顯示miR-425過(guò)表達(dá)能夠明顯抑制結(jié)直腸癌干細(xì)胞的自我更新能力、結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。雙熒光素酶證實(shí)miR-425通過(guò)抑制PDL1的表達(dá)抑制結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)。因此，本研究系統(tǒng)研究了miR-425抑制腫瘤干細(xì)胞干性和分子機(jī)制。與本文研究結(jié)果一致，賈等[6]研究證實(shí)miR-425能夠通過(guò)降低PDL1表達(dá)抑制結(jié)直腸癌生長(zhǎng)和增殖能力。綜上所述，探究了miR-425在結(jié)直腸癌干細(xì)胞中的作用及其發(fā)揮生物功能的分子機(jī)制，為結(jié)直腸癌的治療提供新的靶標(biāo)。