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        不同狼毒愈傷組織的抑菌活性及化學(xué)成分GC-MS分析

        2018-10-16 07:14:00肖澤豐李曉旭劉名飛朱昌叁王俊麗
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年18期
        關(guān)鍵詞:狼毒提物調(diào)節(jié)劑

        肖澤豐,李曉旭,劉名飛,朱昌叁,郝 娜,王俊麗

        (中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,北京100081)

        狼毒(Stellera chamaejasme L.)又名斷腸草,是瑞香科(Thymelaeaceae)狼毒屬(Stellera)多年生草本植物[1]。有清熱解毒、消腫、瀉火等功效。狼毒主要成分有黃酮類[2]、二萜類[3-4]、香豆素類及木脂素類[5-6],具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[7-8]。近年來有關(guān)狼毒化學(xué)成分和抗腫瘤、抗艾滋病方面的研究取得了迅速的發(fā)展,狼毒還被用于生物農(nóng)藥,以毒攻毒取得了明顯的效果?,F(xiàn)階段國內(nèi)研究可采用組織培養(yǎng)技術(shù),通過添加不同植物生長調(diào)節(jié)劑的方式,可刺激狼毒的次生代謝產(chǎn)物的積累,提高有效藥物成分的含量。

        本研究對(duì)不同生長調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)條件下的狼毒愈傷組織進(jìn)行乙醇提取,通過抑菌圈法探究醇提物對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli)、四疊球菌(Micrococcus tetragenus)、白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的抑菌活性進(jìn)行了分析,并通過GC-MS分析其化學(xué)成分,以期得出不同植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)其抑菌活性和成分積累的影響,為狼毒的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與菌種

        野生狼毒植株采自北京市東靈山海拔1 800 m左右的向陽山坡上。所用菌種為大腸桿菌、四疊球菌、白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌。

        1.2 方法

        1.2.1 愈傷組織醇提物的制備 以狼毒葉片為外植體,通過添加不同濃度的萘乙酸(NAA)、6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、苯基噻二唑基脲(TDZ)、激動(dòng)素(KT)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)等生長調(diào)節(jié)劑進(jìn)行培養(yǎng),誘導(dǎo)愈傷組織。將誘導(dǎo)出的愈傷組織于50℃條件下烘干、粉碎并稱質(zhì)量,用95%的乙醇(材料與乙醇比為1∶20)30℃條件下浸提3次,抽濾,風(fēng)干,計(jì)算產(chǎn)率。

        1.2.2 抑菌活性的測定

        1.2.2.1 抑菌實(shí)驗(yàn)樣品及對(duì)照品的配制 稱取一定量的乙醇提取物,配制成為100.00 mg/mL的甲醇溶液,再分別以甲醇為溶劑配制成為5.00 mg/mL和10.00 mg/mL的溶液;配制5.00 mg/mL和10.00 mg/mL的青霉素鈉溶液。

        1.2.2.2 菌懸液的制備 將大腸桿菌、四疊球菌、白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌接種培養(yǎng)(37℃搖床活化培養(yǎng)24 h)后,用無菌生理鹽水稀釋成含菌量為106~107CFU/mL的菌懸液備用。

        1.2.2.3 抑菌圈法測定 將直徑為0.6 cm的無菌濾紙片貼在已涂布0.2 mL菌懸液的培養(yǎng)基上,用移液槍在每個(gè)濾紙片上加入20μL不同濃度的甲醇樣品溶液,37℃恒溫培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。重復(fù)3次,取平均值。青霉素鈉作為陽性對(duì)照。

        1.2.3 樣品的GC-MS分析

        1.2.3.1 柱前衍生化 取一定量乙醇提取物于1.5 mL離心管,加入足量無水CaCl2,75℃放置1 h使提取物徹底干燥。每份樣品加入250μL硅烷化試劑[雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)與吡啶比為5∶1],75℃衍生化1.5 h。

        1.2.3.2 測試條件 使用AGILENT 5975/6890N型氣質(zhì)聯(lián)用儀測定提取物的化學(xué)組分。毛細(xì)管柱為 HP-35 ms(30.0 m × 0.25 mm × 0.25 μm),載 氣 為 He,流 速 為1 mL/min,進(jìn)樣量為1μL,進(jìn)樣口溫度為280℃。測定程序:柱溫60℃,保持1 min;10℃/min升溫至180℃,保持1 min;再以20℃/min升溫至280℃,保持5 min。質(zhì)譜條件:電子轟擊源(EI),電壓70 eV,掃描范圍20~800 u,根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NISTOS結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化合物,進(jìn)行乙醇提取物主要成分分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同材料醇提物的產(chǎn)率

        由表1可知,生長調(diào)節(jié)劑影響著醇提物的產(chǎn)率,30個(gè)愈傷組織樣品中有25個(gè)產(chǎn)率高于MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織的產(chǎn)率,培養(yǎng)基中加入NAA 2.0 mg/L的樣品21產(chǎn)率最高,為23.27%,加入 KT 2.0 mg/L的樣品 25產(chǎn)率最低,為6.47%。研究結(jié)果表明。NAA 2.0 mg/L最有利于愈傷組織干物質(zhì)積累。

        表1 不同材料醇提物的產(chǎn)率

        2.2 抑菌活性的測定

        2.2.1 不同樣品對(duì)大腸桿菌的抑制作用 對(duì)32個(gè)樣品進(jìn)行了抑菌活性分析,研究發(fā)現(xiàn)4、24、25、MS、W這5個(gè)樣品對(duì)大腸桿菌的抑制效果好(表2)。其中W(野生狼毒根)各濃度抑菌效果最強(qiáng),其最小抑菌濃度(MIC)為0.78 mg/mL;其次是樣品25(添加KT 2.0 mg/L)與MS(無生長調(diào)節(jié)劑),MIC均為12.50 mg/mL;樣品 4(添加 NAA 1.0 mg/L+6 -BA 0.5 mg/L)和樣品 24(添加 KT 1.0 mg/L)的 MIC 均為25.00 mg/mL,抑菌活性最差。

        2.2.2 不同樣品對(duì)四疊球菌的抑制作用 32個(gè)樣品中8、10、28、MS、W這5個(gè)樣品抑制四疊球菌效果較好。其中樣品W(野生狼毒根)的MIC為3.13 mg/mL,抑菌效果最好;樣品8(添加 NAA 0.5 mg/L+TDZ 2.0 mg/L)的 MIC 為25.00 mg/mL;樣品10(添加 NAA 2.0 mg/L+TDZ 2.0 mg/L)與樣品28(添加2,4 -D 1.0 mg/L)的 MIC 均為12.50 mg/mL。樣品MS(無生長調(diào)節(jié)劑)在濃度為6.25 mg/mL時(shí),就具有抑菌活性,與野生根相差最小。

        2.2.3 不同樣品對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用 通過研究發(fā)現(xiàn),8、10、14、25、28、W 這 6 個(gè)樣品抑制金黃色葡萄球菌效果較好。其中效果最好的為 W(野生狼毒根),其 MIC為1.56 mg/mL;樣品 10(添加 NAA 2.0 mg/L+TDZ 2.0 mg/L)與樣品28(添加2,4 -D 1.0 mg/L)的MIC 均為6.25 mg/mL;樣品 8(添加 NAA 0.5 mg/L+TDZ 2.0 mg/L)、樣品 14(添加TDZ 4.0 mg/L)和樣品 25(添加 KT 2.0 mg/L)的 MIC 約為12.50 mg/mL;在較高濃度下,樣品8、10、14 和28 的抑菌圈較大,抑菌效果隨著濃度的降低顯著下降。而W(野生狼毒根)的抑菌圈大小則是隨濃度的減小有先增加后降低的趨勢(shì),說明野生狼毒根醇提物在一定濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性。由表4可知,對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性最好的為樣品10和樣品28。

        表2 不同樣品對(duì)大腸桿菌的抑菌作用

        表3 不同樣品對(duì)四疊球菌的抑制作用

        表4 不同樣品對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用

        2.2.4 不同樣品對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用 在32個(gè)樣品中,4、22、MS、W這4個(gè)樣品抑制枯草芽孢桿菌效果較好。其中效果最好的為樣品 W(野生狼毒根),其 MIC為3.13 mg/mL;樣品 MS 的 MIC 為 6.25 mg/mL;樣品 4(添加NAA 1.0+6 -BA 0.5 mg/L)與樣品22(添加 NAA 4.0 mg/L)的MIC分別為12.50 mg/L和25.00 mg/mL(表5)。

        表5 不同樣品對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用

        2.2.5 不同樣品對(duì)白色葡萄球菌的抑制作用 研究表明,4、8、17、21、22、24、25、W 這 8 個(gè)樣品抑制白色葡萄球菌效果較好。其中效果最好的為 W(野生狼毒根),其 MIC為0.39 mg/mL;其次是樣品25(添加 KT 2.0 mg/L)與樣品8(添加 NAA 0.5 mg/L+TDZ 2.0 mg/L),其 MIC 均為3.13 mg/mL;樣品4(添加 NAA 1.0 mg/L+6 -BA 0.5 mg/L)、樣品21(添加 NAA 2.0 mg/L)和樣品22(添加NAA 4.0 mg/L)的MIC 均為 6.25 mg/mL;樣品 17(添加 6 -BA 2.0 mg/L)的 MIC 為12.50 mg/mL;樣品24(添加 KT 1.0 mg/L)的抑菌效果最差,MIC 為25.00 mg/mL(表6)。

        2.2.6 不同樣品的GC-MS分析 如表7所示,多個(gè)樣品含有短鏈的醇和酸,并且相對(duì)含量差異較大,如丁二酸在樣品25中的相對(duì)含量為10.426%,但在樣品4中則只有0.068%,說明添加KT 2.0 mg/L的培養(yǎng)基有利于狼毒愈傷組織產(chǎn)生丁二酸。在樣品4、8、13及21中均檢測到木脂素類化合物,其中樣品 8的相對(duì)含量最高,為 9.740%,說明 MS+NAA 0.5 mg/L+TDZ 2.0 mg/L培養(yǎng)基有利于木脂素的積累。

        在樣品 21、25、29及 W 中檢測到甾醇類,添加 KT 2.0 mg/L的培養(yǎng)基中樣品相對(duì)含量最高,為1.225%,高于W的含量(0.857%)。已有研究表明植物甾醇在降低血液膽甾醇含量、抑制腫瘤、防治前列腺肥大、抑制乳腺增生和調(diào)節(jié)免疫等方面都有重要作用[8]。葡萄籽油屬于多酚類,是強(qiáng)抗氧化物質(zhì),對(duì)冠心病和骨質(zhì)疏松癥都有良好的預(yù)防作用。在所測樣品中,只有樣品25和W含有,而且在樣品25中的相對(duì)含量為1.839%,高于樣品W的含量(0.767%)。

        表6 不同樣品對(duì)白色葡萄球菌的抑制作用

        表7 不同樣品的化學(xué)成分及相對(duì)含量

        另外,樣品8中所檢測到的成分多為氨基酸和醇類、酸類,說明添加NAA 0.5 mg/L與TDZ 2.0 mg/L的培養(yǎng)基較其他類型培養(yǎng)基更利于氨基酸的積累。樣品4中檢測到表兒茶素,表明添加NAA 1.0 mg/L與6-BA 0.5 mg/L的培養(yǎng)基更有利于黃酮類的積累。

        3 結(jié)論

        植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織醇提物的抑菌活性有很大影響。培養(yǎng)基中添加KT 2.0 mg/L所誘導(dǎo)的愈傷組織(樣品25)對(duì)大腸桿菌的抑制效果好,培養(yǎng)基中添加NAA 2.0 mg/L+TDZ 2.0 mg/L(樣品10)和添加 2,4 -D 1.0 mg/L(樣品 28)抑制四疊球菌和金黃色葡萄球菌效果較好,培養(yǎng)基中添加NAA 0.5 mg/L+TDZ 2.0 mg/L(樣品 8)和 KT 2.0 mg/L(樣品25)抑制白色葡萄球菌效果較好,培養(yǎng)基中添加NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L(樣品4)抑制枯草芽孢桿菌效果較好。

        植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織中化合物的合成與積累有一定的影響。NAA 0.5 mg/L與TDZ 2.0 mg/L有利于氨基酸和木脂素類化合物的積累。NAA 1.0 mg/L與6-BA 0.5 mg/L的培養(yǎng)基有利于黃酮類化合物的積累,KT 2.0 mg/L有利于甾醇類的積累。

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