王楨璐，姚東林，謝少林，3，范蘭芬，鄒記興，周愛國，3，4

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，廣東廣州510642;2.廣東省清遠(yuǎn)市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣東清遠(yuǎn)511510;3.清遠(yuǎn)市北江水產(chǎn)科學(xué)研究所，廣東清遠(yuǎn)511510;4.廣東省清遠(yuǎn)市興漁水產(chǎn)科技有限公司，廣東清遠(yuǎn)511510)

鯉亞科(Cyprininae)魚類在魚類分類學(xué)中屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)。中國鯉亞科魚類共有五屬，分別為鲃鯉屬(Puntioplites Smith)、原鯉屬(Procypris Lin)、鯉 屬 (Cyprinus)、須 鯽 屬 (Carassioides)和 鯽 屬(Carassius)［1］。其中，鯉在華南地區(qū)有華南鯉亞種的分布，華南鯉遍布華南地區(qū)的幾乎所有流域。

目前，對(duì)鯉的研究已經(jīng)從傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)研究轉(zhuǎn)向分子生物學(xué)方面的研究。通過對(duì)中國鯉中的紅鯉資源進(jìn)行形態(tài)學(xué)、分子遺傳學(xué)等方面的研究，獲取了中國6個(gè)紅鯉種群的全面數(shù)據(jù)，為紅鯉的育種奠定了基礎(chǔ)［2］。2010年，中國首次完成了鯉魚的全基因組測(cè)序;2013年，中國學(xué)者從形態(tài)學(xué)、染色體組型和同工酶等方面對(duì)山東省東平湖的野生鯉魚資源進(jìn)行了全面研究［3］。這些研究工作為中國鯉亞科魚類的研究提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。線粒體(mitochondrion)作為真核生物細(xì)胞中的一種雙層膜細(xì)胞器，為有氧呼吸提供場(chǎng)所，并為細(xì)胞提供能量。線粒體存在于細(xì)胞質(zhì)中，其內(nèi)部存在一定的遺傳物質(zhì)，因此線粒體DNA為細(xì)胞外遺傳物質(zhì)。細(xì)胞色素b(Cyt b)和細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)是常用的線粒體標(biāo)記基因［4－7］。細(xì)胞色素b(Cyt b)基因進(jìn)化速度適中，其變異主要為轉(zhuǎn)換和顛換，因此在不同科、屬、種中能較好地顯示進(jìn)化關(guān)系，常用于構(gòu)建物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系［8－9］。細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)作為分子標(biāo)記具有諸多優(yōu)勢(shì)，有足夠的變異且相對(duì)保守、有合適的序列長(zhǎng)度、可用通用引物擴(kuò)增和測(cè)序等，其分子標(biāo)記作為DNA條形碼可快速鑒定物種，近年來被廣泛應(yīng)用于物種鑒定［10－15］。

目前，有關(guān)華南鯉的研究資料很少，華南鯉的資源狀況尚不清楚。該研究以線粒體Cyt b和COⅠ基因?yàn)榉肿訕?biāo)記，結(jié)合2個(gè)標(biāo)記各自的進(jìn)化特點(diǎn)，在每個(gè)基因片段獨(dú)立分析的基礎(chǔ)上，分析不同地區(qū)華南鯉種群遺傳多樣性，有助于了解其資源現(xiàn)狀，為其資源保護(hù)工作提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

該研究華南鯉(Cyprinus carpio rubrofuscus Lacepede)樣品分別采至海南萬泉河(21尾)、珠江水系的高明河(31尾)和廣東榕江(22尾)，共采集74個(gè)樣品。樣本采集是隨當(dāng)?shù)貪O民出船捕撈獲得，剪取新鮮樣品的肌肉和尾鰭組織，加入95%乙醇后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品DNA采用海洋組織提取試劑盒提取(天根生化科技有限公司)、Taq DNA聚合酶采用寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品，試驗(yàn)中其他試劑均為分析純，測(cè)序送至上海英駿公司進(jìn)行。試驗(yàn)根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的鯉科目魚類相關(guān)序列，并參考其他文獻(xiàn)的報(bào)道，結(jié)合兩者信息用Editseq及Primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物［14－15］，COⅠ 基因:上游引物 F，5'－ TCA ACCAACCACAAAGACATTGGCAC－3';下游引物 R，5'－TAGAC TTCTGGGTGGCCAAAGAATCA －3'。Cyt b基因，上游引物 F，5'－GACTTGAAAAACCACCGTTG －3';下游引物 R，5'－CCTCAGAAGGATATTTGTCCTC －3'。

1.2 方法

1.2.1 華南鯉基因組DNA提取 取保存于95%乙醇中的樣品80～100 mg，用去離子水沖洗1遍，再放入有去離子水的燒杯中漂洗2 min，用濾紙吸干后置于1.5 mL離心管內(nèi)。先加入50μL裂解液，用剪刀剪碎組織樣品后，再加入450μL裂解液和10μL蛋白酶K用漩渦振蕩器混合20 s，置水浴鍋中55℃恒溫裂解，裂解時(shí)間視具體裂解效果而定，一般3～7 h。完全裂解后，按照海洋組織DNA提取試劑盒的操作說明進(jìn)行提取，提取產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取效果，后置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 華南鯉Cyt b和COⅠ基因PCR擴(kuò)增與測(cè)序 PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL，包括 dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL，10×buffer 5μL，Taq DNA 聚合酶(1 U/μL)2 μL，上下游引物各1 μL。

PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性7 min(Cyt b)和4 min(COⅠ);94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s(Cyt b)和1 min(COⅠ)，35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、膠回收(采用TaKaRa凝膠純化試劑盒)后送至上海英駿公司，在ABI 3730自動(dòng)測(cè)序儀上用正向引物進(jìn)行單向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Chromas 2.23軟件查看序列的測(cè)序效果，并以此為依據(jù)判斷測(cè)序是否準(zhǔn)確。使用MEGA 6.06軟件的Clustal W功能進(jìn)行序列比對(duì)并進(jìn)行人工矯正，然后計(jì)算平均堿基數(shù)、堿基組成比例、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)等數(shù)值，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。使用DNASP(版本號(hào)為4.5)軟件進(jìn)行中性假說檢驗(yàn)(Fu's Fs和Tajima's D算法)和核苷酸分析，并計(jì)算平均核苷酸差異值和核苷酸多樣性。使用Allequin V 3.5.1.3軟件分析單倍型多樣性和單倍型組成等。

2 結(jié)果與分析

2.1 華南鯉Cyt b和COⅠ基因的序列組成及變異

該試驗(yàn)獲得并分析Cyt b和COⅠ基因序列均為52個(gè)，其中海南鯉分別為16、19個(gè)，珠江鯉17、16個(gè)，榕江鯉19、17個(gè)。對(duì)華南鯉3個(gè)種群線粒體Cyt b和COⅠ基因進(jìn)行序列測(cè)定，用Clustal W軟件進(jìn)行序列比對(duì)，人工校正后共得到分析序列長(zhǎng)度分別為729 bp(Cyt b)和610 bp(COⅠ)。序列的簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)，T、C、A、G、A+T、C+G 含量見表1。

3個(gè)種群Cyt b基因序列共檢測(cè)到22個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，其中海南鯉最多，16個(gè)樣本共檢測(cè)到簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)10個(gè)，海南鯉 T、C、A、G 含量分別為 26.97%、30.42%、28.91%、13.72%，A+T的含量(55.88%)明顯高于 C+G的含量(44.12%);珠江鯉17個(gè)樣本共檢測(cè)到簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)4個(gè)，T、C、A、G、A+T、C+G 含量分別為 28.48%、29.05%、29.05%、13.43%、57.52%、42.48%;榕江鯉 19 個(gè)樣本共檢測(cè)到簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)8個(gè)，T、C、A、G、A+T和C+G含量分別為 27.10%、30.28%、28.66%、13.96%、55.76%和 44.24%。

3個(gè)種群COⅠ基因序列共檢測(cè)到13個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，其中海南鯉19個(gè)樣本共檢測(cè)到簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)4個(gè)，T、C、A和G 含量分別為 26.94%、29.13%、27.05%、16.89%，A+T 的含量(53.99%)明顯高于C+G的含量(46.02%);珠江鯉16個(gè)樣本共檢測(cè)到簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)5個(gè)，T、C、A、G、A+T和C+G含量分別為 27.20%、28.88%、27.14%、16.78%、54.34%、45.66%;榕江鯉17個(gè)樣本共檢測(cè)到簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)4個(gè)，T、C、A、G、A+T、C+G 含量分別為 27.20%、28.86%、27.16%、16.77%、54.37%、45.63%。

表1 華南鯉3個(gè)種群Cyt b和COⅠ基因序列特征

2.2 基于Cyt b和COⅠ基因序列對(duì)華南鯉種群遺傳距離的分析

應(yīng)用MEGA 6.06計(jì)算該研究的華南鯉3個(gè)種群的Kimura雙參數(shù)模型遺傳距離、平均遺傳距離、各種群內(nèi)的平均遺傳距離、兩兩種群間的凈遺傳距離。由表2可知，線粒體Cyt b基因序列的核苷酸分化速率為 2%/百萬年［16－17］，由試驗(yàn)結(jié)果可知，海南鯉與珠江鯉和榕江鯉的分化年代較遠(yuǎn)，大約在2.5萬年和2.65萬年前，而珠江鯉和榕江鯉之間的的分化年代大約在1.5萬年前。

對(duì)3個(gè)群體間的遺傳分化指數(shù)進(jìn)行計(jì)算發(fā)現(xiàn)，Cyt b和COⅠ基因分析結(jié)果一致，珠江鯉和榕江鯉兩群體間的FST值統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)不顯著(P＞0.05);海南鯉同珠江鯉、榕江鯉兩群體間的FST值統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均顯著(p＜0.05)。由此可知，珠江鯉和榕江鯉兩群體間的遺傳分化不顯著，而海南鯉同珠江鯉和榕江鯉種群產(chǎn)生了一定程度的遺傳分化。

2.3 基于Cyt b和COⅠ基因序列對(duì)華南鯉種群遺傳結(jié)構(gòu)分析

由表3可知，華南鯉3個(gè)種群52個(gè)樣本共計(jì)13個(gè)(Cyt b)和12個(gè)(COⅠ)單倍型，其中海南鯉有10、5個(gè)單倍型，珠江鯉有均7個(gè)單倍型，榕江鯉有6、5個(gè)單倍型。3個(gè)華南鯉種群共同單倍型分別為4、2種，分別為Cyt b基因(Hc3、Hc5、Hc7和Hc8)、COⅠ基因(Hd1和Hd4)。分析Cyt b基因序列發(fā)現(xiàn)，除了4種共有單倍型外，海南鯉和珠江鯉無其他共同單倍型，而與榕江鯉也無其他共同單倍型，此外還有Hc4、Hc6、Hc9、Hc10 4種特有單倍型;珠江鯉除4種共有單倍型外，還與榕江鯉有2種共同單倍型:Hc11和Hc13，Hc12為其特有單倍型。

表2 華南鯉種群間遺傳距離分析

由表4可知，各群體的核苷酸多樣性指數(shù)較低，單倍型多樣性指數(shù)整體均較高。分析Cyt b基因序列單倍型多樣性和核苷酸多樣性可知，海南種群均最高，而珠江、榕江鯉相對(duì)較低，其中珠江鯉的核苷酸多樣性(0.002 68)明顯小于海南鯉(0.006 37)。而分析COⅠ基因序列發(fā)現(xiàn)，海南鯉群體的遺傳多樣性(0.003 13)較珠江鯉和榕江鯉(0.003 51)低。通過Tajima's D和Fu's Fs進(jìn)行中性檢驗(yàn)，結(jié)果表明華南鯉3個(gè)種群內(nèi)的Tajima's D和Fu's Fs值均不具備顯著差異性。

2.4 基于Cyt b和COⅠ基因單倍型序列對(duì)華南鯉種群聚類分析

采用Mega 5.0軟件對(duì)華南鯉3個(gè)種群Cyt b和COⅠ基因單倍型序列進(jìn)行 NJ聚類分析，bootstrap(重復(fù)次數(shù)為1 000)檢驗(yàn)NJ樹各分支置信度，由圖1可知，各地理種群無序分布于個(gè)分支，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的地理聚群、地理結(jié)構(gòu);各種群間沒有明顯的譜系結(jié)構(gòu)。

表3 Cyt b和COⅠ基因序列單倍型及其分布

表4 華南鯉種群的遺傳變異參數(shù)統(tǒng)計(jì)

3 分析與討論

3.1 華南鯉種群序列特征分析

線粒體Cyt b和COⅠ基因是目前常用的分子標(biāo)記，試驗(yàn)運(yùn)用序列測(cè)定技術(shù)分析華南鯉3個(gè)種群的Cyt b和COⅠ基因序列特征。脊椎動(dòng)物線粒體一般特征為“高(A+T)含量且低G含量”［18］，華南鯉3個(gè)種群的Cyt b和COⅠ基因序列也符合這一特征，與李青等對(duì)星斑川鰈、黃蓋鰈、石鰈，線粒體Cyt b和COⅠ基因序列的研究結(jié)果［19］相符。研究表明，堿基中A+T的含量越高，線粒體DNA的進(jìn)化優(yōu)勢(shì)越明顯［20］。海南鯉、珠江鯉、榕江鯉的 A+T的含量分別為 55.88%、57.52%、55.76%(Cyt b)，53.99%、54.34%、54.37%(COⅠ)，均明顯高于C+G的含量。此外，無論Cyt b還是COⅠ基因的序列，珠江鯉的堿基中A+T含量都是最高的，這表明珠江鯉相對(duì)于海南鯉、榕江鯉具有更強(qiáng)的進(jìn)化優(yōu)勢(shì)，可能與珠江鯉處于珠江流域生存環(huán)境有關(guān)，珠江作為中國第二大河流，年徑流量大、流經(jīng)地域廣，較海南鯉所處的海南島萬泉河水系和榕江鯉所在的榕江水系更為復(fù)雜。

3.2 華南鯉種群遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是物種適應(yīng)環(huán)境、不斷進(jìn)化的基礎(chǔ)，一個(gè)物種的遺傳多樣性與其進(jìn)化潛力、適應(yīng)能力和生存能力密切相關(guān)［21－22］。華南鯉3個(gè)種群Cyt b基因序列平均遺傳距離為0.003 1，52尾個(gè)體檢測(cè)出13個(gè)單倍型，總?cè)后w單倍型多樣性為0.874，核苷酸多樣性指數(shù)為0.004 15，平均核苷酸差異數(shù)為3.027?；贑OⅠ基因序列的分析表明，3個(gè)種群Cyt b基因序列平均遺傳距離為0.003 0，檢測(cè)出12個(gè)單倍型，總?cè)后w單倍型多樣性為0.770，核苷酸多樣性指數(shù)為0.003 38，平均核苷酸差異數(shù)為1.835。核苷酸多樣性能精確的揭示一個(gè)群體線粒體DNA的多態(tài)性程度［23］。研究表明，華南鯉的核苷酸多樣性遠(yuǎn)小于南海圓舵鰹的核苷酸多樣性(0.036 81)［24］。當(dāng)一個(gè)群體核苷酸多樣性指數(shù)在 0.001 5 ～0.004 7時(shí)，其群體的遺傳多樣性較低［25］。該研究結(jié)果表明，3種華南鯉的遺傳多樣性不高。此外，華南鯉3個(gè)種群基于Cyt b和COⅠ基因序列均具有較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性的特征，這與曹艷等對(duì)中國南?？凳像R鮫［26］和熊丹等對(duì)南海短尾大眼鯛的研究結(jié)果［27］相似，故推測(cè)華南鯉近期歷史上有種群快速擴(kuò)張情況，因此單倍型多樣性會(huì)增加，但由于時(shí)間不夠長(zhǎng)，核苷酸的變異還沒有形成累積效應(yīng)，故核苷酸多樣性較低。但Tajima's D和Fu's Fs中性檢驗(yàn)均不具備顯著性差異，則表明華南鯉沒有出現(xiàn)群體擴(kuò)張，出現(xiàn)這一矛盾的原因可能是該研究的樣品數(shù)量及采樣點(diǎn)較少。

3.3 華南鯉種群的遺傳分化

分析華南鯉Cyt b和COⅠ基因的序列組成及變異發(fā)現(xiàn)，珠江鯉和榕江鯉的A+T含量十分接近，且均較高;而海南鯉的A+T含量均較低。基于Cyt b和COⅠ基因序列對(duì)華南鯉種群遺傳距離的分析發(fā)現(xiàn)，珠江鯉與榕江鯉之間的遺傳距離均為0.003 0，是3個(gè)種群間遺傳差距最小的數(shù)值。而其他兩兩之間的遺傳距離均在0.004 7～0.005 6之間。通過分析華南鯉3個(gè)群體的NJ進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，3個(gè)群體散亂分布于各支，未出現(xiàn)明顯單一的地理聚群;從Cyt b基因的進(jìn)化樹上可見珠江和榕江2個(gè)群體有更多的交集，而海南群體產(chǎn)生了一定的遺傳分化;從COⅠ基因的進(jìn)化樹上可見珠江和海南種群相對(duì)較為集中，與榕江種群均有交集，這些結(jié)果也體現(xiàn)了一定的遺傳進(jìn)化和地理格局的分布。

Heather等根據(jù)FST大小劃定了群體的分化程度:高度分化，F(xiàn)ST＞0.25;中度分化，0.05 ＜ FST≤0.25;低度分化，0 ＜FST≤0.05，作為群體遺傳分化標(biāo)準(zhǔn)被廣泛認(rèn)可［28］。在對(duì)華南鯉種群遺傳結(jié)構(gòu)的分析中，海南鯉和珠江鯉、榕江鯉2個(gè)種群間基于Cyt b基因序列的FST值分別為0.076 9和0.064 2;基于COⅠ 基因序列的FST值分別為0.404 4和0.401 3，均遠(yuǎn)高于高度分化標(biāo)準(zhǔn)(0.25);而珠江鯉和榕江鯉間基于Cyt b基因序列的FST值為－0.027 7，基于COⅠ基因序列的FST值為0.003 5，均低于海南鯉和珠江鯉、榕江鯉2個(gè)種群間的FST值。

綜上分析，在3個(gè)華南鯉種群中，海南鯉相對(duì)于其他2個(gè)種群遺傳分化較大，而珠江鯉和榕江鯉有較近的遺傳關(guān)系，之間的遺傳分化相對(duì)較小。另外，珠江鯉和榕江鯉的遺傳分化指數(shù)沒有顯著差異，而同海南鯉的差異顯著，這與3個(gè)種群的地理位置有一定關(guān)系。珠江鯉所在的珠江水系是華南地區(qū)最大的水系，其每年水量巨大且支流眾多［29］，與榕江鯉所在的榕江水系有一定接觸，2個(gè)種群間的交流更加頻繁，故珠江鯉和榕江鯉的遺傳分化指數(shù)差異不顯著。而海南鯉主要分布于海南島，本次試驗(yàn)所用海南鯉采集于海南島萬泉河水系，所處地區(qū)未受到深度開發(fā)，與外界產(chǎn)生交流少［30］，故同珠江鯉、榕江鯉的遺傳分化指數(shù)差異顯著。