劉 波，王慶奎，邢克智，陳成勛

(天津市水產(chǎn)生態(tài)與養(yǎng)殖重點實驗室/天津農(nóng)學院水產(chǎn)學院，天津300384)

點帶石斑魚(Epinephelus malabaricus)隸屬鱸形目(Perciformes)科(Serranidae)，廣泛分布于中國東南沿海。點帶石斑魚對環(huán)境適應性強、肉質(zhì)鮮美，含有豐富的高不飽和脂肪酸，是一種低脂肪、高蛋白的上等食用魚［1］，被中國港澳地區(qū)推為中國四大名魚之一，素有“海雞肉”之稱。伴隨著石斑魚集約化養(yǎng)殖的興起，石斑魚健康水平下降，細菌性、病毒性疾病頻發(fā)［2－3］。而常用的化學消毒劑和抗生素等藥物，不僅導致病原微生物產(chǎn)生耐藥性［4］，而且少量藥物也殘留在石斑魚體內(nèi)［5］，對人體健康有潛在的危害。

許多中草藥多糖具有生物安全、可降解、環(huán)境友好等優(yōu)點，能提高水產(chǎn)動物免疫力和抗病力，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中受到廣泛關注［6］，抗氧化系統(tǒng)是非特異性免疫的重要組成部分，較強的抗氧化能力有助于機體免疫力的提高。研究發(fā)現(xiàn)，中草藥多糖可通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性和相關抗氧化基因的表達，來提高對抗活性氧自由基的能力，飼料中添加牛膝多糖(Achyranthes bidentata)能提高草魚(Grass carp)SOD、CAT活力，降低 MDA含量［7］。對擬穴青蟹(Scylla Paramamosain)注射大黃多糖(Rheum palmatum L)后發(fā)現(xiàn)，過氧化氫酶、過氧化物還原酶、酚氧化酶原等免疫基因分別在血細胞和肝胰腺中明顯上調(diào)，推測可能與擬穴青蟹免疫增強有關［8］。

當歸多糖(Angelica sinensis polysaccharide，ASP)是傘形科植物當歸的主要活性成分之一［9］。研究發(fā)現(xiàn)，當歸多糖能通過提高血液白細胞的吞噬能力和頭腎白細胞的增殖能力，并促進點帶石斑魚的呼吸爆發(fā)活力、吞噬活力、降低遲緩愛德華菌(Edwardsiella tarda)攻毒后試驗魚的累計死亡率來提高點帶石斑魚的非特異性免疫力和抗病力［10－11］。通過激活TLR22及其下游相關基因Toll樣接頭蛋白TRIF，干擾素調(diào)節(jié)因子IRF3主要組織相容性復合體(MHC)與腫瘤壞死因子(TNF－α)、白介素－8(IL－8)的方式調(diào)節(jié)石斑魚的免疫功能［12］。改善抗氧化能力是多糖調(diào)節(jié)機體免疫力的機理之一［13］，通過體外試驗證實當歸多糖能夠有效清除對生物體毒性強、危害大的超氧陰離子自由基和羥基自由基，抑制脂質(zhì)過氧化［14］，但當歸多糖對魚類抗氧化能力方面的研究較少，本試驗研究當歸多糖對點帶石斑魚CuZn－SOD、Mn－SOD、CAT抗氧化活力以及相關基因CuZn－SOD、Mn－SOD、CAT mRNA的表達量的影響，為揭示當歸多糖調(diào)節(jié)點帶石斑魚抗氧化能力的機理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用點帶石斑魚(89.61±2.08)g由天津市海發(fā)珍品實業(yè)發(fā)展有限公司提供。當歸購于天津市當?shù)刂胁菟幨袌?，產(chǎn)地甘肅。本試驗采用水提醇沉的方法［15］提取當歸多糖(ASP)。

1.2 試驗設計

選擇健康且大小相近的點帶石斑魚450尾魚隨機分配到15個玻璃鋼水槽(86 cm×62 cm×45.5 cm)，每個水槽30尾，將 ASP 按0、2 000、4 000、6 000、8 000 mg/kg 添加到基礎飼料(表1)中，每種飼料喂食3槽試驗魚，連續(xù)投喂42 d后采樣。每組每次采樣12尾，取樣前停食24 h，取樣魚用MS－222麻醉，用0.2 mL無菌注射器尾靜脈取血，用8%肝素鈉抗凝，收集血漿(4℃，4 000 r/min離心15 min);將采血后的試驗魚進行解剖，取肝胰臟，－80℃冰箱中保存。測定血漿和肝胰臟 CuZn－SOD、Mn－SOD、CAT酶活力和 CuZn－SOD、Mn－SOD、CAT基因表達量。

表1 試驗餌料配方及其營養(yǎng)成分

表2 引物序列

1.3 試驗條件和日常管理

試驗水槽安置在石斑魚室內(nèi)工廠化養(yǎng)殖的水泥池中。試驗用海水為石斑魚循環(huán)水養(yǎng)殖用水，海水經(jīng)生物包處理、充純氧，紫外線消毒后，以0.3～0.8 m/s流速流入飼養(yǎng)水槽，過多的海水從出水管溢出，不再使用。試驗期間水質(zhì)條件為:水溫26.5 ～27.8 ℃，鹽度23% ～26%，溶氧量 8.24 ～8.52 mg/L，pH 值7.2 ～8.6，銨態(tài)氮(－N)含量0.009 ～0.011 mg/L，亞硝態(tài)氮(NO2－N)0.023～0.028 mg/L。每日 08:00 和16:00各投喂1次，每次飽食投喂，并避免產(chǎn)生殘餌。

1.4 抗氧化指標

血漿及肝胰臟中的超氧化物歧化酶(CuZn－SOD和Mn－SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性采用南京建成生物研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。

1.5 總RNA提取和cDNA的合成

用Trizol試劑(大連寶生物工程有限公司)提取肝胰臟中的總 RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)合成cDNA第1條鏈，反應依據(jù)產(chǎn)品說明書進行。經(jīng)測濃度后的樣本按個人要求選擇反轉(zhuǎn)錄的用量，10μL反應體系中保證總 RNA的量在500 ng以下。在200μL離心管中加入2μL 5×PrimeScript RT Master Mix和個人所需的RNA模板溶液，最后用ddH2O將溶液補齊至10μL。反應條件:37℃保溫15 min，85℃保溫5 s，然后置于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 肝胰臟 CuZn－SOD、Mn－SOD、CATm RNA表達水平測定

1.6.1 引物設計 根據(jù)GeneBank已上傳的斜帶石斑魚的CAT序列(AY735009.1)、Mn － SOD 序列(AY735007.1)、CuZn－SOD序列(AY035854.1)和已上傳的赤點石斑魚的β－actin序列(HQ007251.1)，利用序列間的保守區(qū)域設計用于實時熒光定量PCR的引物(表2)，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.6.2 實時熒光定量 PCR 按照 SYBR Premix Dimer EraserTM(Perfect Real Time)試劑盒說明書操作。PCR擴增體系為20 μL，包括 10 μL SYBR Premix Dimer EraserTM、0.5 μL上游引物、0.5μL下游引物、2μL cDNA和 7μL ddH2O。

PCR反應程序:95℃預變性3 min;95℃變性15 s，退火60 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)40 次。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

CuZn－SOD、Mn－SOD、CATm RNA的表達以β－actin為內(nèi)參，參照對照組mRNA表達量，應用2－ΔΔCt計算mRNA的相對表達量。數(shù)據(jù)采用用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，作單因素方差分析，采用Duncan's法進行多重比較，p＜0.05表示差異顯著。數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”表示(n=3)。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 提取的RNA質(zhì)量

測定的D260nm/D280nm的比值在1.8～2.1之間，可以說明提取的RNA純度較高，符合試驗要求。瓊脂糖凝膠電泳5S rRNA、18SrRNA、28SrRNA 3條條帶清晰完整(圖1)。

2.2 CuZn－SOD酶活力及基因

由圖 2－A、圖 2－B可知，喂食 42 d后，血漿8 000 mg/kg組與處理組差異不顯著，其他組顯著低于對照組;肝胰臟CuZn－SOD酶活力在6 000 mg/kg處理組顯著高于對照組，其他組顯著低于對照組。

由圖2－C可知，喂食42 d后，隨ASP添加量的升高，CuZn－SOD基因表達量先降低后升高再降低，6 000 mg/kg明顯高于對照組，2 000、4 000 mg/kg明顯低于對照組。

2.3 Mn－SOD酶活力以及基因

由圖3－A、圖3－B可知，喂食42 d后，隨ASP添加量的升高，血漿處理組Mn－SOD酶活力先降低后升高再降低，2 000 mg/kg組明顯低于對照組，其他組與對照組無顯著差異;肝胰臟Mn－SOD酶活力先升高后降低再升高，各處理組均明顯高于對照組，在2 000 mg/kg達到最大值。

由圖3－C可知，喂食42 d后，Mn－SOD基因表達量在6 000 mg/kg明顯大于對照組及其他組，在2 000、8 000 mg/kg明顯低于對照組。

2.4 CAT抗氧化酶活力以及基因

由圖4－A、圖4－B可知，喂食42 d后，血漿CAT酶活力在8 000 mg/kg明顯小于對照組，其他組與對照組差異不顯著;肝胰臟中各處理組隨ASP添加量的升高CAT酶活力先升高后降低，2 000、6 000 mg/kg處理組顯著高于對照組，其他組與對照組差異不顯著。

由圖4－C可知，喂食42 d后，6 000 mg/kg組CAT基因表達量顯著高于對照組，其他組與對照組差異不顯著。

3 討論

超氧化物歧化酶(SOD)作為活性氧清除劑參與清除體內(nèi)自由基，與水生生物的免疫水平密切相關，對于增強整個機體的免疫功能具有重要作用［16］。研究發(fā)現(xiàn)，汪開毓等以鯽魚(Crucain carp)為研究對象，投喂無花果(Ficus carica)多糖后可顯著提高其血液SOD活性［17］;白東清等證實，長期投喂黃芪(Astraglusseu)多糖可顯著黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)頭腎和肌肉中 SOD酶活力［18］;李春震等對黑鯛(Sparus inacrocephalus)投喂不同濃度的人參多糖飼料后發(fā)現(xiàn)，人參多糖能顯著提高黑鯛SOD基因表達量［19］。本試驗中，隨著ASP添加量的升高，肝胰臟CuZn－SOD酶活力及其基因表達量均呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢，肝胰臟Mn－SOD酶活力呈現(xiàn)先升高后降低再升高，Mn－SOD基因表達量先降低后升高再降低，綜合來看，添加量在6 000 mg/kg時肝胰臟CuZn－SOD、Mn－SOD酶活力和基因表達量明顯高于對照組，這與高穎暉等報道的小鼠補充殼聚糖(chitosan)，能夠增加力竭運動小鼠肝組織SOD酶活性和基因表達量活性的研究結(jié)果［20］一致，基因表達量可以提高其編碼蛋白的表達量，從而提高相應酶活力［21］，當歸多糖可通過上調(diào)CuZn－SOD、Mn－SOD基因表達來提高點帶石斑魚CuZn－SOD、Mn－SOD酶活力，促進機體免疫機制保護機體免受損傷。研究發(fā)現(xiàn)，ASP添加量在2 000、4 000 mg/kg時，血漿、肝胰臟 CuZn－SOD酶活力和基因表達量均明顯小于對照組，推測是當歸多糖濃度過低，無法達到對基因表達所需的濃度范圍，對抗氧化系統(tǒng)的產(chǎn)生干擾，從而抑制了 CuZn－SOD基因的表達，使 CuZn－SOD mRNA轉(zhuǎn)錄水平降低，進而使CuZn－SOD蛋白合成減少，CuZn－SOD酶活力降低。

過氧化氫酶(CAT)是機體內(nèi)不需要特殊供體而能夠執(zhí)行的第一道抗氧化防線任務的重要抗氧化酶。試驗結(jié)果顯示，喂食當歸多糖6 000 mg/kg時能顯著提高肝胰臟CAT酶活力和CAT表達量，與SOD結(jié)果一致，這可能與兩者之間的功能有關，SOD和CAT是反映有機體抗氧化能力的2個重要指標，前者催化超氧化物歧化為過氧化氫，后者催化過氧化氫還原成水和氧，兩者酶活力具有一定的同步性［22］，活性氧產(chǎn)生后，CAT活力量隨SOD活力及其反應產(chǎn)物的增加而相應提高，將過氧化氫還原，從而降低組織過氧化損傷。類似地，血鸚鵡攝食牛膝(Achyranthes bidentata)多糖后，羅非魚攝食黃芪多糖后，SOD和CAT活力也表現(xiàn)出一致性［23－24］。

綜上所述，當歸多糖能顯著影響點帶石斑魚肝胰臟CuZn－SOD、Mn－SOD、CAT酶活力，并且在 6 000 mg/kg顯著上調(diào)CuZn－SOD、Mn－SOD、CAT基因的表達量。

致謝:感謝天津農(nóng)學院王曉梅教授、石洪玥實驗師和天津市海發(fā)珍品實業(yè)有限公司在本試驗石斑魚養(yǎng)殖過程中提供的幫助，對此深表謝意!