李玉萍，吳春雷，王燕青，羅鳳霞

(1.金陵科技學(xué)院園藝學(xué)院，江蘇南京210038;2.南京市中山陵園管理局，江蘇南京21001)

墨蘭(Cymbidium sinense)別稱報歲蘭，蘭科蘭屬多年生草本，原產(chǎn)我國、越南和緬甸。葉片劍形，深綠色，具光澤;花莖通常高出葉面，在野生狀態(tài)下可達80～100 cm，有花7～17朵，萼片披針形，淡褐色，有5條紫褐色的脈，花瓣短寬，唇瓣三裂不明顯，先端下垂反卷?；ㄆ?—3月，品種甚多，少數(shù)在秋季開花［1－2］。

大花蕙蘭(C.grandiflorum)別稱西姆比蘭、虎頭蘭，系指原產(chǎn)于喜馬拉雅山、印度、緬甸、泰國等地蕙蘭的大型花原種以及以它為基礎(chǔ)雜交而得到的品種，具有植株強健、花大花多、花色艷麗、花期長等優(yōu)點［3－4］，是世界上栽培最普及的蘭花之一，享有“蘭花皇后”的美譽［3］。尤其是當代的大花蕙蘭品種，都是經(jīng)過多代雜交選育出的優(yōu)良品種。與原種比較，花型規(guī)整，花瓣寬，花朵優(yōu)美，色彩艷麗而豐富，花莖直立而挺拔，花朵數(shù)目多且排列緊密，深受國內(nèi)外蘭花愛好者的歡迎，具有較大的市場潛力。但大花蕙蘭在自然狀態(tài)下繁殖困難，種子萌發(fā)率極低，僅為5%左右，且大花蕙蘭傳統(tǒng)分株繁殖周期長，效率低［5］，難以滿足規(guī)?；a(chǎn)的需要。

大花蕙蘭與墨蘭分別以花大色艷、生長健壯與多花芳香等優(yōu)良性狀而深受世界各地人們的歡迎，但目前，國內(nèi)蘭花市場上的蘭花品種大都受到蘭花產(chǎn)地以及蘭花生態(tài)習(xí)性等的限制，從而無法達到人們的觀賞性要求，同時也給一些蘭花優(yōu)良品種的推廣帶來了極大的難度。曾碧玉等都曾報道過大花蕙蘭與墨蘭之間的雜交試驗，但結(jié)實率相對都較低，且不同品種間雜交結(jié)實率相差較大，正交與反交結(jié)實率也有一定差異［6－7］。

本試驗以3個墨蘭品種及3個大花蕙蘭品種為親本進行雜交，在研究親本生物學(xué)特性的同時，對其花粉活性、人工雜交授粉特性和雜種胚的發(fā)育過程等進行研究，以期能夠結(jié)合大花蕙蘭與墨蘭的優(yōu)良性狀，創(chuàng)造出開花數(shù)量多、兼具國蘭香氣同時抗性強的蘭花新品種，并為今后培育具有自主知識產(chǎn)權(quán)的蘭花新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以金陵科技學(xué)院幕府校區(qū)園藝學(xué)院2014年12月引種的盆栽中國蘭為材料，具體品種名稱及特性為:富貴(墨蘭)，花深紅褐色，芳香，水仙瓣型;白墨(墨蘭)，花黃綠色，芳香，素心瓣型;閩南大梅(墨蘭)，花深紅色，芳香，水仙瓣型;黃金大富貴(大花蕙蘭)，花黃色，直立中花型;黃金歲月(大花蕙蘭)，花黃色，直立中花型;綠GZ(大花蕙蘭)，花綠色，淡香，直立大花型。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉活力測定 采用雙凹槽載玻片懸滴法進行花粉離體培養(yǎng)。2015年3月以盛花期08:30—10:30采集的白墨花粉為材料，根據(jù)郭麗霞等養(yǎng)基配方經(jīng)改良設(shè)計了 L9(34)正交試驗［8］(表1)?；ǚ鄄苫睾笕∵m量放在潔凈的載玻片凹槽內(nèi)，滴加蒸餾水浸泡，待花粉塊吸水膨脹變成黃白色時，用鑷子輕夾，直至花粉塊變成糊狀。之后將預(yù)先配制好的培養(yǎng)液滴于雙凹槽載玻片上，用鑷子輕攪，使花粉分散懸浮在培養(yǎng)液滴內(nèi)。再將制好的載玻片放入鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，蓋上蓋子，在25℃的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)4 h后開始鏡檢，以后每隔4 h鏡檢1次，直至花粉管數(shù)目基本穩(wěn)定時統(tǒng)計花粉萌發(fā)率。每個處理重復(fù)3次，每個重復(fù)觀察不少于100粒的花粉。當花粉管長度大于花粉粒直徑的2倍時，計為萌發(fā)?；ǚ勖劝l(fā)率 =(萌發(fā)的花粉數(shù)/鏡檢的花粉總數(shù))×100%。在得出適宜培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上采集其他品種的花粉，進行花粉生活力測定。

1.2.2 雜交親和性 以墨蘭3個品種為母本分別與大花蕙蘭3個品種進行雜交，探討各組合間的雜交親和性。待母本花葶伸出，花朵開放前先行除蕾:選擇保留花葶中部偏下3～4朵花蕾，其余全部摘除。小花盛開時授粉，因蘭花蕊腔開口朝下且分泌有黏液，授粉后花粉塊會牢牢粘在蕊腔中，不須套袋，去除唇瓣即可。授粉后加強肥水管理，病蟲害防治并定期觀察果實發(fā)育狀況，30 d后統(tǒng)計子房膨大數(shù)，120 d后統(tǒng)計果實數(shù)量，并分別計算子房膨大率和結(jié)實率。

表1 花粉生活力測定液體培養(yǎng)基配方

1.2.3 雜交幼胚離體培養(yǎng) 以雜交組合獲得的3個月以上未開裂的黃綠色果實為材料。流水沖洗后，先用75%乙醇消毒1 min，無菌水沖洗 2～3次，再用 0.1%氯化汞浸泡20 min，無菌水沖洗3次。滅菌后將果實切開，將幼胚接種到萌發(fā)培養(yǎng)基上，每個組合每個處理至少接種3瓶。培養(yǎng)基設(shè)計3 種，分別為:1 號，1/2MS+0.3 mg/L IBA+0.05 mg/L 6 －BA+2 g/L AC;2 號，1/2MS+0.3 mg/L IBA+0.05 mg/L 6 －BA+2 g/L 蛋白胨 +2 g/L AC;3 號，1/2MS+0.3 mg/L IBA+0.05 mg/L 6－BA+100 mg/L 谷氨酰胺 +2 g/L AC。

以上培養(yǎng)基各加入20 g/L蔗糖和7.5 g/L瓊脂，pH值5.4，在121℃條件下滅菌25 min。培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照14 h/d，光照度2 000 lx。接種后60 d開始，每周觀察統(tǒng)計雜交種子萌發(fā)情況。所有試驗均在金陵科技學(xué)院幕府校區(qū)園藝學(xué)院實驗室完成。150 g/L時，花粉萌發(fā)率明顯降低，平均萌發(fā)率降至8.47%，培養(yǎng)基8號花粉萌發(fā)率僅為4.5%，這可能是高含量的蔗糖溶液引起了花粉質(zhì)壁分離從而降低了花粉活力。對白墨花粉萌發(fā)率影響次之的是氯化鈣含量，含量為10 mg/L時花粉萌發(fā)最好，平均萌發(fā)率為43.73%。硼酸含量與GA3含量與花粉萌發(fā)影響較小，硼酸含量為5 mg/L，花粉萌發(fā)率最高，平均為39.70%;GA3各含量對花粉萌發(fā)的影響不明顯，極差僅為1.6%。綜合分析，白墨(墨蘭)花粉萌發(fā)適宜培養(yǎng)基為5號，即100 g/L蔗糖+5 mg/L硼酸+10 mg/L CaCl2+10 mg/L GA3。

表2 白墨花粉萌發(fā)率統(tǒng)計及極差分析

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉活力

蘭屬植物花粉不開散，是由許多四分體花粉聚合而成的，扁圓形的、兩大兩小的4個花粉塊。大花蕙蘭和墨蘭當天開放花朵花粉均為鮮艷的黃色，隨著開放時間的增加，花粉塊失水顏色逐漸加深，約1周后變?yōu)楹稚?，完全失水成硬塊，無法碾碎，并失去黏性。在顯微鏡下觀察，新鮮花粉呈四合體狀，花粉萌發(fā)時，一般四合體的每一個花粉小孢子都可以長出花粉管，但并非所有四合體均能萌發(fā)4個花粉管，有的花粉細胞發(fā)生不同程度的質(zhì)壁分離現(xiàn)象(表2)。

由表2可知，在不同培養(yǎng)基上花粉的萌發(fā)率不同，在4個影響因子中，蔗糖含量對白墨花粉萌發(fā)的影響最大，當蔗糖含量為100 g/L時，花粉萌發(fā)率最高，平均達到52.07%，其中培養(yǎng)基5號花粉萌發(fā)率達到了60.3%。蔗糖含量增高到

在選定花粉萌發(fā)最佳培養(yǎng)基基礎(chǔ)上采集其他品種花粉進行測定，閩南大梅、富貴、黃金歲月、黃金大富貴、綠GZ的花粉萌發(fā)率分別為 51.2%、56.4%、21.0%、19.5%、20.4%。由此可知，該培養(yǎng)基比較適合墨蘭3個品種的花粉萌發(fā)，花粉萌發(fā)率均高于50%。3個大花蕙蘭品種花粉在該培養(yǎng)基上都有萌發(fā)，萌發(fā)率也較接近，約20%，在雜交育種時可作為父本授粉。

2.2 雜交親和性

大花蕙蘭開花后1周內(nèi)花粉具有較高的活力，可以進行人工授粉，但以開花后1～3 d的花粉受精情況最好。授粉后3個墨蘭品種的花瓣在1周后即發(fā)生萎蔫。人工授粉后，子房在花粉的刺激下，大都會有不同程度的膨大，但授粉后柱頭和子房的膨大并不意味著受精的完成。子房膨大后1個月內(nèi)不斷有較小的果實黃化脫落，直至授粉后3個月，仍會有果實變黃逐漸脫落現(xiàn)象發(fā)生(表3)。

由表3可知，9個雜交組合子房雖都有膨大，但在發(fā)育后期除3個組合有果實保留下來，其余均脫落，這可能與遠緣雜交存在受精后障礙有關(guān)。在獲得果實的3個組合中，閩南大梅×黃金歲月授粉40朵，僅獲得1個果實，坐果率為2.5%;白墨×黃金歲月坐果率為18.4%;白墨×黃金大富貴坐果率為23.3%。結(jié)果說明墨蘭3個品種與大花蕙蘭3個品種間的親和性較低。

表3 各雜交組合人工授粉結(jié)果情況

雜交親和性的高低與親本的遺傳背景有關(guān)，各親本的染色體倍數(shù)相近，雜交親和力高，雜交結(jié)果相應(yīng)就高。大花蕙蘭在其育種歷程中，不斷有不同程度的染色體加倍現(xiàn)象出現(xiàn)，使其倍性復(fù)雜化，有二倍體，也有三倍體或四倍體，但以三倍體居多;而墨蘭大多為二倍體［9］。倍性不同的父母本雜交時受精情況不良、合子胚的發(fā)育不正常、正常胚的數(shù)量很少等均會導(dǎo)致果實敗育。此外，倍性差異引起無法形成正常配子及存在的生殖隔離也會對雜交果實的發(fā)育產(chǎn)生很大影響。

雜交授粉后出現(xiàn)的落果嚴重現(xiàn)象，可能與蘭屬植物的胚胎生物學(xué)特性有關(guān)，沒有完成雙受精是造成這種現(xiàn)象的主要原因。因為蘭花授粉后，蘭屬的孢原細胞直接行使大孢子母細胞的功能，這段時間即開始表現(xiàn)子房的膨大，但受精過程并沒有進行?；ǚ墼谥^上42 h以后才會萌發(fā)花粉管，花粉管的伸長也比較緩慢，40～45 d以后才可以到達胚珠。

2.3 雜交幼胚胚離體培養(yǎng)

將雜交后100～120 d的雜交幼胚經(jīng)無菌播種到3種培養(yǎng)基上，種胚在培養(yǎng)60 d后逐漸開始萌發(fā)，先由白色逐漸變成褐色和部分小綠點，后逐漸轉(zhuǎn)綠，體積增大，形成肉眼可見的原球莖。各雜交組合在不同培養(yǎng)基的萌發(fā)啟動時間與萌發(fā)情況不盡相同，培養(yǎng)180 d后統(tǒng)計其萌發(fā)率，因種子仍呈團塊狀未完全散開，難以計算其萌發(fā)率，僅以接種數(shù)和萌發(fā)數(shù)情況來計(表4)。

表4 雜交幼胚在各培養(yǎng)基上的萌發(fā)狀況

由表4可知，不同雜交組合幼胚在各培養(yǎng)基上的萌發(fā)率不同。3個雜交組合中除閩南大梅×黃金歲月在1號培養(yǎng)基上沒有萌發(fā)，在其他培養(yǎng)基上都有萌發(fā)。在2號培養(yǎng)基上均有萌發(fā)良好，平均萌發(fā)率為69.31%，其中白墨×黃金大富貴雜交幼胚萌發(fā)率達到85.71%;其次是3號培養(yǎng)基，3個組合幼胚平均萌發(fā)率達到37.56%。由此可知，在培養(yǎng)基中添加有機物有利于蘭屬雜交幼胚的萌發(fā)，尤其是蛋白胨促進了胚的萌發(fā)。

3 結(jié)論與討論

花粉離體液體萌發(fā)法是測定蘭花花粉生活力的有效手段，但培養(yǎng)基的不同組分對花粉生活力的影響有差異。蔗糖含量對白墨花粉萌發(fā)的影響最大，其次是硼酸含量。蔗糖含量以100 g/L為佳，含量過高會抑制花粉的萌發(fā)，這與郭麗霞等的研究結(jié)果［8］一致。蔗糖在花粉萌發(fā)中除了提供能源外，還起著調(diào)節(jié)花粉細胞與培養(yǎng)液之間滲透壓的作用。蔗糖含量過低會造成花粉細胞破裂，原生質(zhì)外流;含量過高，則易導(dǎo)致花粉細胞原生質(zhì)體脫水而質(zhì)壁分離，從而抑制花粉萌發(fā)。在一定范圍內(nèi)，B3+、Ca2+、GA3含量均對蘭花花粉的萌發(fā)有一定促進作用，三者中以B3+含量影響最大。張義等發(fā)現(xiàn)，GA3可促進花粉萌發(fā)［10－11］，本試驗也得到了同樣結(jié)論。

墨蘭和大花蕙蘭不同品種的花粉生活力不同，墨蘭3個品種的花粉生活力均高于大花蕙蘭，即白墨(603.%)＞富貴(56.4%) ＞閩南大梅(51.2%);黃金歲月(21.0%) ＞ 綠 GZ(20.4%) ＞ 黃金大富貴(19.5%)，這與凌春英的研究結(jié)果［9］一致。因此，在進行雜交育種時，應(yīng)盡可能選擇花粉活力高的品種作為父本，從而在一定程度上提高結(jié)果率。本試驗僅開展了以墨蘭為母本的雜交，以墨蘭各品種為父本能否提高雜交結(jié)實率還須要進一步探討。

以墨蘭為母本，大花蕙蘭為父本的9個雜交組合雖子房均有膨大，但只有3個組合獲得了雜交胚，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是所選品種的育性不同，且品種間親和力也有所差異;此外，栽培管理及氣候條件也有一定的影響［6］。在6個品種中白墨作母本有2個組合獲得了雜交胚，黃金歲月作父本有2個組合獲得了雜交胚。即墨蘭3個品種中白墨更適合作母本，大花蕙蘭黃金歲月更適合作父本。

授粉后絕大多數(shù)子房都有不同程度的膨大，但是果實發(fā)育過程中存在早期敗育問題，這種子房的膨大是由于花粉均已萌發(fā)花粉管伸長到子房中引起的正常生長發(fā)育膨大，還是由于人工授粉的刺激導(dǎo)致的內(nèi)部激素的反應(yīng)，從而導(dǎo)致子房膨大，這有待進一步深入研究。

種子的萌發(fā)與否與種子的成熟度密切相關(guān)，但有關(guān)種子成熟度與萌發(fā)率的關(guān)系許多研究結(jié)果并不一致。國蘭種子的采收時期因不同組合而異，主要是觀察蒴果外觀變化，果皮的光澤度降低且微微泛黃時采收為佳，以130～190 d萌發(fā)效果較好。

培養(yǎng)基是蘭花雜交育種過程中雜種胚拯救和初期生長的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，對蘭花雜交幼胚無菌萌發(fā)起關(guān)鍵性作用。在培養(yǎng)基中添加一定的有機物可以促進蘭花雜交幼胚的萌發(fā)，在添加蛋白胨的培養(yǎng)基上3個組合的雜交幼胚均有較好的萌發(fā)，平均萌發(fā)率達到了69.31%，其中白墨×黃金大富貴雜交幼胚萌發(fā)率達到85.71%，此外萌發(fā)的原球莖長勢好，這與曾宋君等的研究結(jié)果［12－13］一致。培養(yǎng)基 1/2MS+0.3 mg/L IBA+0.05 mg/L 6－BA+2 g/L蛋白胨+2 g/L AC更適于3個雜交組合幼胚的無菌萌發(fā)。