李蘭君，劉玳含，劉建斌，武鳳霞，朱英波

(1.河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院，河北秦皇島066600;2.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源研究所，北京100097;3.北京城市學(xué)院城市建設(shè)學(xué)部，北京100083)

進(jìn)入20世紀(jì)90年代，隨著溫室大棚、地膜覆蓋等技術(shù)的發(fā)展，設(shè)施農(nóng)業(yè)隨之迅速發(fā)展［1］，設(shè)施蔬菜已經(jīng)成為我國(guó)蔬菜生產(chǎn)的重要組成部分。近年來(lái)，由于人均耕地的減少、經(jīng)濟(jì)需要等原因，設(shè)施菜地的復(fù)種指數(shù)、集約化程度的增加使得設(shè)施菜地連作現(xiàn)象十分普遍。隨著連作年限的增加，出現(xiàn)設(shè)施蔬菜產(chǎn)量降低、病蟲害加劇等現(xiàn)象。連作障礙已經(jīng)成為限制設(shè)施蔬菜高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要因素［2－3］。

長(zhǎng)期連作破壞土壤穩(wěn)定性，設(shè)施菜地中普遍存在土壤肥力下降、土壤次生鹽漬化及土壤酸化［4－6］，嚴(yán)重影響植物對(duì)水肥的吸收利用，影響植物生長(zhǎng)發(fā)育。吳道銘等對(duì)南方酸性紅壤的研究表明，長(zhǎng)期種植單一作物破壞土壤結(jié)構(gòu)及土壤通透性，使土壤水鹽失衡進(jìn)而加劇土壤酸化及鋁毒現(xiàn)象［7］。番茄連作的研究表明，連作使得土壤質(zhì)量下降，土壤養(yǎng)分失衡，對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)、土壤全氮、速效鉀、速效磷等都有很大影響［8－9］。土壤微生物是生態(tài)系統(tǒng)的重要一環(huán)，在土壤物質(zhì)循環(huán)能量流動(dòng)中具有不可替代的作用［10－11］。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及土壤酶活性是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最活躍的部分，能敏感地反映出土壤的質(zhì)量和狀態(tài)，是評(píng)價(jià)土壤環(huán)境的重要指標(biāo)［12－13］。大量研究表明，土壤連作障礙與微生物的關(guān)系密切［14－16］。長(zhǎng)期連作使土壤微生物生態(tài)環(huán)境失衡［17－18］。隨著連作年限的增加，土壤細(xì)菌數(shù)量下降而土壤真菌數(shù)量上升［19］，真菌與細(xì)菌比值上升，土壤由肥力高的細(xì)菌型轉(zhuǎn)變?yōu)榉柿Φ偷恼婢?。Mazzola研究表明連作病害多來(lái)自真菌［20］。馬寧寧等對(duì)設(shè)施番茄的研究表明，連作使土壤可培養(yǎng)微生物的種類下降，部分土著微生物滅絕［21］。馬海燕等對(duì)非洲菊的研究表明，脲酶含量隨連作年限的增加先增加后下降［22］。土壤中過(guò)氧化氫酶活性隨番茄連坐年限增加緩慢增加而后逐漸下降，也有研究表明土壤過(guò)氧化氫酶活性隨著連作年限的增加而上升［23］。本研究對(duì)北京市房山區(qū)的設(shè)施番茄連作土壤進(jìn)行了理化指標(biāo)、微生物指標(biāo)和酶活性指標(biāo)的綜合分析，明確了不同指標(biāo)的變化規(guī)律及指標(biāo)之間的相關(guān)性，以期為設(shè)施連作土壤的改良提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2015年12月在北京市房山地區(qū)的設(shè)施蔬菜大棚選取番茄連作土壤作為試驗(yàn)土壤樣品，共10個(gè)試驗(yàn)區(qū)，設(shè)施蔬菜的連作年限分別為 0、1、3、5、6、7、8、9、10、20 年。取得樣品后當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室，一部分樣品在于4℃保存，用于微生物測(cè)定;一部分土壤樣品在陰涼處風(fēng)干，撿出植物殘?bào)w、石塊及其他雜物。將風(fēng)干后土壤樣品碾碎，通過(guò)1 mm及0.25 mm篩子的土壤樣品備用。

1.2 土壤理化性質(zhì)的測(cè)定

土壤有機(jī)質(zhì)含量測(cè)定采用K2Cr2O7氧化－外加熱法，全氮含量測(cè)定采用凱氏定氮法，速效鉀含量測(cè)定采用NH4OAc浸提－火焰光度法，有效磷含量測(cè)定采用NaHCO3浸提－鉬銻抗比色法，電導(dǎo)率使用電導(dǎo)率儀測(cè)定，pH值使用pH儀測(cè)定，水 ∶土 =5 ∶1［24］。

1.3 微生物純培養(yǎng)試驗(yàn)及DNA提取方法

土壤微生物數(shù)量采用稀釋平板法測(cè)定，細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 d后計(jì)數(shù)，真菌采用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)3～5 d后計(jì)數(shù)。

土壤細(xì)菌、真菌DNA分別使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、真菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取，細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增，引物為27F(5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3')和1492R(5'－TACGGCTACCTTCGACTT-3')，真菌ITSrDNA擴(kuò)增，引物為ITS1(5'－TCCGTAGGTGAAGCGG－3')和ITS4(5'－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3')［25］。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物由北京諾賽基因組研究中心有限公司測(cè)序分析。

1.4 土壤酶活性測(cè)定方法

土壤過(guò)氧化氫酶活性采用KMnO4滴定法測(cè)定，以1 g土消耗的0.1 mol/L KMnO4的體積(mL)表示。土壤脲酶活性采用比色法測(cè)定，以3 h后1 g土含有的的量(mg)表示［25］。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 連作年限對(duì)設(shè)施番茄土壤理化性質(zhì)的影響

研究發(fā)現(xiàn)，隨著連作年限的增加，設(shè)施番茄土壤的全氮、速效鉀、有效磷含量均逐漸增高然后下降，分別在連作7年、7年、6年達(dá)到最高值，比未連作土壤增加幅度分別達(dá)87.50%、751.93%、497.09%(表1)。其中土壤全氮含量在連作20年與未連作土壤相比差異不顯著，其他連作年限全氮含量顯著高于未連作土壤，土壤速效鉀、有效磷含量皆顯著高于未連作土壤。土壤有機(jī)質(zhì)含量變化趨勢(shì)與土壤的全氮、速效鉀、有效磷含量變化趨勢(shì)類似，在連作6年達(dá)到最高值，比未連作土壤增加幅度達(dá)到122.45%。由此可見(jiàn)，在連作過(guò)程中土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效鉀、有效磷處于先積累后消耗的狀態(tài)。

隨著連作年限的增加，土壤pH值顯著下降，在連作8年達(dá)到最低值，較未連作土壤下降了0.7，在連作20年土壤pH值有所恢復(fù)。隨著連作年限的增加，土壤電導(dǎo)率先上升后下降，在連作5年達(dá)到最大值，較未連作土壤增加幅度達(dá)到8.34%，連作1年到連作6年與未連作土壤差異不顯著，連作7年到連作20年土壤電導(dǎo)率顯著低于未連作土壤。

2.2 連作年限對(duì)可培養(yǎng)土壤微生物的影響

2.2.1 連作年限對(duì)設(shè)施番茄土壤可培養(yǎng)土壤微生物數(shù)量的影響 研究發(fā)現(xiàn)，隨著連作年限的增加，設(shè)施番茄土壤細(xì)菌數(shù)量呈先上升后下降趨勢(shì)(圖1)。在連作6年達(dá)到最高值，增加幅度為1 566.67%，連作8年后，細(xì)菌數(shù)量穩(wěn)定，與未連作土壤差異不顯著。真菌數(shù)量變化趨勢(shì)類似于細(xì)菌變化趨勢(shì)，在連作7年達(dá)到最高值，增加幅度為1 209.09%，連作6年與連作7年真菌數(shù)量差異不顯著;連作9年后真菌數(shù)量趨于穩(wěn)定，與未連作土壤差異不顯著。設(shè)施番茄土壤微生物總量變化趨勢(shì)類似于細(xì)菌、真菌變化趨勢(shì)，隨著連作年限的增加設(shè)施番茄土壤微生物總量呈先上升后下降趨勢(shì)，在連作6年達(dá)到最高值(圖2)。土壤中細(xì)菌數(shù)量最多，細(xì)菌是土壤可培養(yǎng)微生物的優(yōu)勢(shì)群體，但隨著土壤連作年限增加，土壤細(xì)菌/真菌一直降低，在連作8年達(dá)到最低值，連作9年后土壤細(xì)菌/真菌開始上升，與連作8年土壤細(xì)菌/真菌差異顯著，與未連作土壤差異不顯著(圖3)。

表1 連作年限對(duì)設(shè)施番茄土壤理化性質(zhì)的影響

2.2.2 連作年限對(duì)設(shè)施番茄土壤可培養(yǎng)土壤微生物種類的影響 隨著番茄連作年限增加，土壤可培養(yǎng)微生物的種類也發(fā)生了很大的變化(表2)。土壤可培養(yǎng)真菌的種類隨連作年限的增加而緩慢減少，連作前6年真菌種類基本是不變的，連作7年后真菌種類開始減少。土壤可培養(yǎng)細(xì)菌種類連作前6年逐漸增加，其中連作3年開始出現(xiàn)微桿菌屬(Microbacterium sp.)、溶桿菌屬(Lysobacter sp.)(表 3)。連作 6、7、8、9、10 年均檢測(cè)到寡養(yǎng)假單胞菌屬(Stenotrophomonas sp.)。連作7年后土壤可培養(yǎng)細(xì)菌種類開始減少，一些土壤細(xì)菌開始消失，其中連作1年出現(xiàn)的堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus)，在連作10、20年都沒(méi)有發(fā)現(xiàn);地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)存在于連作3～8年，連作9、10、20年均未發(fā)現(xiàn)該菌。

表2 連作年限對(duì)設(shè)施番茄土壤可培養(yǎng)真菌種類的影響

2.3 連作年限對(duì)設(shè)施番茄土壤酶活性的影響

土壤酶廣泛參與土壤中各種生物化學(xué)過(guò)程，其活性反應(yīng)了土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化能力及土壤微生物的活性。其中過(guò)氧化氫酶參與土壤中各種化合物的氧化反應(yīng)，并且能促進(jìn)過(guò)氧化物的分解，避免其對(duì)植物的毒害作用。脲酶直接參與土壤中的氮循環(huán)，能在一定程度上反映土壤的供氮能力。隨著連作年限的增加，設(shè)施番茄土壤過(guò)氧化氫酶活性先增加后下降，在連作6年達(dá)到最高值，增加幅度為19.18%，連作6、7年過(guò)氧化氫酶活性顯著高于未連作土壤，連作20年過(guò)氧化氫酶活性顯著低于未連作土壤，其他連作年限過(guò)氧化氫酶活性與未連作土壤差異不顯著(圖4)。隨著連作年限的增加，設(shè)施番茄土壤脲酶活性先顯著上升后顯著下降，在連作5年達(dá)到最高值，增加幅度為27.03%，連作3、5、6年脲酶活性顯著高于未連作土壤，連作7年后脲酶活性顯著低于未連作土壤，連作9、10、20年之間脲酶活性差異不顯著(圖5)。

2.4 連作番茄土壤理化性質(zhì)、酶活性、微生物數(shù)量相關(guān)性分析

研究發(fā)現(xiàn)，土壤脲酶活性與土壤電導(dǎo)率相關(guān)系數(shù)最大，為0.935(表4)。土壤過(guò)氧化氫酶活性與土壤全氮含量、有機(jī)質(zhì)含量相關(guān)性較大，相關(guān)系數(shù)分別為0.804、0.828，說(shuō)明土壤全氮含量、有機(jī)質(zhì)含量較高時(shí)，土壤過(guò)氧化氫酶活性隨之增加。土壤細(xì)菌數(shù)量、真菌數(shù)量與土壤有機(jī)質(zhì)含量相關(guān)系數(shù)都較高，分別達(dá)到0.759、0.925，土壤有機(jī)質(zhì)含量較高時(shí)，適于土壤真菌、細(xì)菌的生長(zhǎng)。土壤有效磷含量與土壤真菌數(shù)量、細(xì)菌數(shù)量相關(guān)系數(shù)為0.753、0.659，土壤速效鉀含量與土壤真菌數(shù)量、細(xì)菌數(shù)量相關(guān)系數(shù)為0.760、0.303。真菌數(shù)量和細(xì)菌數(shù)量均與有機(jī)質(zhì)含量的相關(guān)性最大。

表3 連作年限對(duì)設(shè)施番茄土壤可培養(yǎng)細(xì)菌種類的影響

3 討論與結(jié)論

長(zhǎng)期連作條件下，土壤理化性質(zhì)、土壤微生物總量、微生物多樣性、土壤酶活性都會(huì)改變，從而影響作物生長(zhǎng)發(fā)育，降低作物產(chǎn)量。土壤微生物是植物根際最活躍的部分，能敏感地反映出土壤生態(tài)系統(tǒng)的變化［12－13，26－27］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨連作年限增加，土壤細(xì)菌、真菌數(shù)量呈先增加后降低趨勢(shì)，細(xì)菌與真菌比值則一直降低甚至連作7年后低于未連作土壤，土壤由細(xì)菌型向真菌型轉(zhuǎn)變，這與前人研究結(jié)果［28－30］一致。此外，連作前期可培養(yǎng)真菌種類較為穩(wěn)定，連作7年后可培養(yǎng)真菌種類減少，連作9、10年僅有2種可培養(yǎng)真菌。連作9、10、20 年均未發(fā)現(xiàn)木霉屬(Trichoderma sp.)真菌，而目前發(fā)現(xiàn)的生防菌多為木霉屬真菌，并且在此之前多屬真菌漸漸消失?？膳囵B(yǎng)細(xì)菌種類隨連作年限先上升后下降，連作10僅有4種可培養(yǎng)細(xì)菌，連作7年后芽孢桿菌種類減少，連作3年后開始出現(xiàn)微桿菌，連作6年后開始出現(xiàn)寡養(yǎng)假單胞桿菌，芽孢桿菌被證實(shí)對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用［31－32］，為根際有益微生物，其他多屬細(xì)菌逐漸消失，總體細(xì)菌多樣性減少。因此，長(zhǎng)期連作使土壤環(huán)境趨向單一化，對(duì)土壤微生物進(jìn)行定向選擇，土壤有益菌減少，有害菌增加。

表4 連作番茄土壤理化性質(zhì)與酶活性、微生物數(shù)量相關(guān)系數(shù)

土壤中酶來(lái)源于土壤微生物和根際分泌物，可以催化土壤中有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化，其中過(guò)氧化氫酶可以分解腐殖質(zhì)形成過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫，減少其對(duì)植物的傷害，脲酶能促進(jìn)土壤中有機(jī)氮向無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)化，提高土壤的供氮能力［26］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，土壤過(guò)氧化氫酶活性隨連作年限先增加后下降，總體變化不明顯，僅有連作20年土壤過(guò)氧化氫酶活性低于未連作土壤。脲酶活性變化明顯，連作前5年增加，之后開始迅速降低，連作7年低未連作土壤。

受溫室大棚過(guò)量施肥、肥料利用率低及得不到雨水充分淋洗等條件影響，設(shè)施菜地土壤的有機(jī)質(zhì)、全氮、速效鉀、有效磷水平普遍較高［33－34］，且均高于露天土壤。本試驗(yàn)結(jié)果表明，連作前期土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效鉀、有效磷水平隨連作年限增加均升高，并且全氮與速效鉀水平在連作7年到達(dá)最大值，有機(jī)質(zhì)和速效磷水平在連作6年達(dá)到最大值，而后開始降低。pH值隨連作年限增加不斷降低，一直處于6.50～7.50間，土壤屬于中性土。電導(dǎo)率先隨連作年限的增加而升高，連作5年達(dá)到最大值，連作7年后降低幅度較大，與有機(jī)質(zhì)、全氮、速效鉀、有效磷變化趨勢(shì)類似。但根據(jù)全國(guó)土壤養(yǎng)分分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(6級(jí)制)，設(shè)施番茄土壤各連作年限有機(jī)質(zhì)含量都達(dá)到3級(jí)，其中連作6、7年達(dá)到1級(jí);土壤全氮含量都達(dá)到3級(jí)，其中連作5、6、7、8年達(dá)到1級(jí);土壤速效鉀、有效磷含量都達(dá)到1級(jí)。說(shuō)明設(shè)施番茄施肥量非常充足，甚至已經(jīng)過(guò)量。

由番茄連作土壤理化性質(zhì)、酶活性、微生物數(shù)量相關(guān)性分析得出，土壤脲酶活性與電導(dǎo)率相關(guān)極顯著，土壤過(guò)氧化氫酶活性與土壤全氮含量、有機(jī)質(zhì)含量相關(guān)性極顯著。土壤真菌數(shù)量、細(xì)菌數(shù)量分別與土壤有機(jī)質(zhì)含量相關(guān)極顯著、顯著。土壤脲酶活性受土壤電導(dǎo)率影響較大，土壤微生物數(shù)量受土壤有機(jī)質(zhì)含量影響較大。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，長(zhǎng)期連作條件下，土壤細(xì)菌與真菌的比值一直下降，土壤由細(xì)菌型轉(zhuǎn)向真菌型，連作前期土壤微生物多樣性、酶活性、土壤養(yǎng)分均處于一個(gè)較高水平，土壤生態(tài)環(huán)境良好。連作6、7年后土壤微生物多樣性降低，土壤微生物數(shù)量降低，酶活性減少，土壤養(yǎng)分減少，土壤質(zhì)量下降，土壤生態(tài)環(huán)境轉(zhuǎn)向惡劣，出現(xiàn)普遍的連作障礙問(wèn)題。因此，在設(shè)施番茄生產(chǎn)中應(yīng)盡量避免連作，對(duì)于長(zhǎng)期連作的番茄產(chǎn)區(qū)可以通過(guò)與其他作物間作、調(diào)節(jié)pH值、合理施肥、施用微生物菌劑等方法防治連作障礙。