王 寧，劉 銅，靳亞忠，咸洪泉

(1.青島農(nóng)業(yè)大學，山東青島266109;2.黑龍江八一農(nóng)墾大學，黑龍江大慶163319)

木霉菌是優(yōu)良的生防真菌，在應用真菌防治土傳病害的研究中，應用最廣泛的真菌殺菌劑便是木霉菌［1］。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡是造成土傳病害發(fā)生的主要原因［2－3］，其多樣性高低是衡量土壤健康與否的一項重要指標［4］。施用木霉菌后，通過對土壤微生物多樣性產(chǎn)生影響來達到防治病害、改良土壤的作用，因此，研究土壤微生物多樣性意義重大。目前微生物多樣性的研究方法多為活菌培養(yǎng)，局限在部分微生物總體數(shù)量研究，對種類的研究比較少，而土壤中的大多數(shù)微生物是無法進行培養(yǎng)的，可培養(yǎng)率只有 0.1% ～1.0%［5－6］。高通量測序具有無需培養(yǎng)、能夠客觀還原菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)據(jù)量大等優(yōu)點［7］，近年來，高通量測序技術不斷發(fā)展，尤其是第二代測序方法，即Illumina 454和SOLiD Ion Torrent具有諸多優(yōu)點［8－10］。這些測序平臺最大數(shù)據(jù)產(chǎn)出通量高，在土壤微生物多樣性的研究中可以獲得豐富的信息［11－12］。因此，筆者試圖通過對土壤微生物基因組進行高通量測序，研究木霉菌施用后對土壤微生物多樣性的影響，為進一步揭示木霉菌和土壤微生物多樣性之間的關系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌劑為青島農(nóng)業(yè)大學研發(fā)的木霉菌可濕性粉劑，棘孢木霉(Trichoderma asperellum)的孢子濃度為1×109CFU/g，草莓品種為紅顏。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間試驗設計 試驗在黑龍江省大慶市薩爾圖區(qū)春雷農(nóng)場塑料大棚內(nèi)進行，木霉菌可濕性粉劑于苗期施用。設木霉菌可濕性粉劑、對照2個處理，小區(qū)面積為0.02 hm2，共3次重復。木霉菌可濕性粉劑處理為將木霉菌可濕性粉劑稀釋300倍進行灌根，灌根量為300 mL/株，對照用等體積的水灌根。灌根時間為2016年11月4日，21 d后采用對角線五點取樣法取草莓根際土。

1.2.2 土壤微生物測序 微生物多樣性研究主要基于編碼核糖體RNA的核酸序列，其中細菌多樣性研究主要是基于16SrDNA V3+V4區(qū)，真菌多樣性研究主要基于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1區(qū)。提取樣品總DNA，細菌V3+V4擴增采用的引物如下:F，5'－ARACTYCTACGGRAGGCWG －3';R，5'－GACTACNVGGGTATCTAATCC－3'。真菌 ITS1擴增引物如下:ZF，5'－AACCTGCGGAAGGATCATT －3';ZR，5'－GARCCAAGAGATCCRTTG－3'。進行PCR擴增并對其產(chǎn)物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，對于建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina HiSeq 2500進行測序。測序由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.2.3 信息分析流程 利用雙末端測序(paired－end)的方法，構(gòu)建小片段文庫進行測序。通過對reads(讀長)拼接過濾，得到優(yōu)化序列(tags)。將優(yōu)化序列進行操作分類單元(operational taxonomic units，簡稱OTUs)聚類，并進行物種注釋及豐度分析，以揭示樣品的物種構(gòu)成。進一步進行α多樣性分析(alpha diversity)，研究單個樣品內(nèi)部的物種多樣性，統(tǒng)計各樣品在97%相似度水平下的 Ace、Chao1、Shannon及Simpson指數(shù)。

1.2.4 草莓生長指標測定 施用木霉菌可濕性粉劑50 d后，測定單株葉片數(shù)及單張葉面積，測定數(shù)量為10株。單張葉面積的測定參考喬寶營等的方法［13］。

1.2.5 草莓灰霉病的調(diào)查 施藥后在生育期內(nèi)定期觀測連作草莓土傳病害的發(fā)生情況，主要調(diào)查整個試驗處理草莓灰霉病的病株數(shù)，并參照朱虹等方法計算防效［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測序結(jié)果評估

通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件處理各階段樣品序列數(shù)，評估數(shù)據(jù)質(zhì)量。各樣品測序數(shù)據(jù)評估結(jié)果如表1、表2所示。

稀釋性曲線(rarefaction curve)用于驗證測序數(shù)據(jù)量是否足以反映樣品中的物種多樣性，并間接反映樣品中物種的豐富程度［15］。由圖1可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著測序數(shù)的增多，若曲線表現(xiàn)為急劇上升，則表示群落中有大量物種被發(fā)現(xiàn);當曲線趨于平緩時，則表示此環(huán)境中的物種并不會隨著測序數(shù)量的增加而明顯增多。稀釋曲線可以作為對各樣本測序量是否充分的判斷，如果曲線急劇上升，表明測序量不足，需要增加序列數(shù);反之，則表明樣品序列充分，可以進行數(shù)據(jù)分析。樣品稀釋曲線分別在測序數(shù)為10 000、20 000條處逐漸趨向平坦，而表1顯示，細菌的優(yōu)化測序數(shù)量超過60 000條，表2顯示，真菌的優(yōu)化序列超過40 000條，說明樣品序列充分，測序數(shù)量合理。

表1 樣品細菌測序數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計

表2 樣品真菌測序數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計

2.2 OTU 劃分結(jié)果

6個樣品測序共獲得479 966對reads，雙端reads拼接、過濾后共產(chǎn)生301 529條tags，平均每個樣品產(chǎn)生 43 076 tags。根據(jù)不同的相似度水平，對所有序列進行OTU劃分，在一般情況下，如果序列之間的相似性高于97%就可以把它定義為1個OTU，每個OTU對應1種代表序列［16］。使用QIIME(version 1.8.0)軟件中的UCLUST對tags在97%的相似度水平下進行聚類，獲得OTU，并基于Silva(細菌)和UNITE(真菌)分類學數(shù)據(jù)庫對OTU進行分類學注釋。由表3看出，各處理組和對照組細菌的總種類數(shù)變化非常小，而真菌種類的數(shù)量差異較大，處理組較對照組真菌種類總數(shù)明顯減少，降低了 17.57%。

表3 通過聚類得到的不同處理土壤中的OTU數(shù)量

2.3 屬水平豐度變化

由圖2可以看出，細菌屬水平的豐度變化表現(xiàn)如下:在土壤中，特呂珀菌屬(Truepera)、Chryseolinea、藤黃單胞菌屬(Luteimonas)、鐵礦沙單胞菌屬(Arenimonas)、鞘鞍醇單胞菌屬(Sphingomonas)、冷菌屬(Algoriphagus)和熱單胞菌屬(Thermomonas)豐度較高，處理組和對照組相比沒有明顯變化。處理組的假單胞菌屬(Pseudomonas)豐度所占比例比對照增加45.8百分點。假單胞菌屬是土壤中病原菌的拮抗菌，其種類和數(shù)量增多有利于土壤健康［17］。

由圖3可以看出，真菌屬水平豐度的變化表現(xiàn)如下:鐮刀菌屬(Fusarium)在T3處理中豐度占比2.41%，T3處理中其他種類真菌數(shù)量較少，鐮刀菌占據(jù)絕對優(yōu)勢，與往年T3處理是根腐病嚴重區(qū)有關。大棚內(nèi)有相同根腐病發(fā)生區(qū)的土壤中，鐮刀菌豐度占比達3.35%，木霉菌處理后下降28.06百分點。豐度占比前10的頭梗霉屬(Cephaliophora)、赤霉菌屬(Gibberella)、毛殼菌屬(Chaetomium)相對豐度明顯減少，分別降低245.20、322.53、38.46 百分點，羽蘚屬(Tetracladium)相對豐度明顯增多，增加348.29百分點。毛殼菌廣泛存在于土壤中，它可以有效降解纖維素和有機物，對微生物產(chǎn)生拮抗作用，是廣泛應用的生防菌［18］。而木霉菌和毛殼菌互相拮抗，所以會造成毛殼菌豐度的減少［19］。

2.4 物種豐度聚類熱圖

Heatmap是以顏色梯度來代表數(shù)據(jù)矩陣中數(shù)值的大小并根據(jù)物種或樣品豐度相似性進行聚類的一種圖形展示方式。將高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過顏色梯度及相似程度來反映多個樣品群落組成的相似性和差異性。在熱圖聚類結(jié)果中，顏色代表物種豐度;縱向聚類表示不同物種在各樣品間豐度的相似情況，2個物種間距離越近，枝長越短，說明這2個物種在各樣品間的豐度越相似;橫向聚類表示不同樣品的各物種豐度的相似情況，與縱向聚類一樣，2個樣品間距離越近，枝長越短，說明這2個樣品的各物種豐度越相似。

從圖4可以看出，木霉菌制劑處理的土樣真菌豐度明顯降低，尤其是處理1和處理3。處理2和對照2橫向聚類豐度相近，縱向聚類豐度差異較大。頭梗霉屬、赤霉菌屬等一些土壤致病菌明顯減少，而圓酵母屬(Torula)、摩西管柄囊霉(Funneliformis)、羽蘚屬(Tetracladium)豐度增加，其中摩西管柄囊霉和羽蘚屬均是菌根真菌，對土壤健康的保持非常重要。21 d后木霉菌的數(shù)量會明顯降低。

2.5 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性有 Chao1、Ace、Shannon、Simpson 等多種衡量指標［20］。其中Chao1和Ace指數(shù)能簡單地反映群落中物種的數(shù)量，而不表示群落中每個物種的豐度信息。Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量群落多樣性，受樣品群落中物種豐度和物種均勻度的影響。Chao1、Ace、Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，說明樣品的物種多樣性越高［21］。另外，本研究還統(tǒng)計了樣本文庫的覆蓋率(Coverage)，其數(shù)值越高，則表明樣本中序列被測出的概率越高，而沒有被測出的概率越低。該指數(shù)可以反映測序結(jié)果是否能夠代表樣本中微生物的真實情況。

從表4、表5可以看出，經(jīng)過木霉菌處理后，土壤微生物多樣性指數(shù)整體上變低，細菌多樣性指數(shù)變化不大，Ace和Shannon指數(shù)變化較小，Chao1和Simpson指數(shù)略微下降。真菌的多樣性指數(shù)明顯降低，對照Ace、Chao1、Shannon指數(shù)分別比處理增加 18.51%、18.81、31.03%;對照 Simpson 指數(shù)比處理降低50.96%。分析原因，可能是由于木霉菌對細菌的拮抗性較小，主要拮抗真菌。

2.6 木霉制劑對草莓植株生長及灰霉病發(fā)生的影響

施入可濕性粉劑后，分別在生育期內(nèi)進行草莓葉片數(shù)量、面積測定。表6結(jié)果表明:處理組的草莓葉片數(shù)量、葉面積均比對照組明顯增加。施藥后50 d時，處理組葉片數(shù)量、葉面積分別比對照組增加10.78%、10.94%，對草莓灰霉病的相對防效達65%。結(jié)果說明，施入木霉菌對草莓植株具有明顯的促生長作用，并對草莓灰霉病有很好的預防和治療作用。

3 結(jié)論與討論

本試驗采用土壤宏基因組高通量測序的方法研究木霉菌制劑施用后對土壤微生物多樣性的影響，結(jié)果表明，施用木霉菌對土壤中細菌多樣性影響較小，但會使真菌多樣性明顯降低。木霉菌對細菌多樣性的影響主要表現(xiàn)為假單胞菌屬數(shù)量明顯增多;對真菌多樣性的影響主要表現(xiàn)為頭梗霉屬、赤霉菌屬和毛殼菌屬等數(shù)量明顯減少，酵母菌、羽蘚屬等數(shù)量明顯增多。木霉菌的施用會造成很多病原菌含量減少，也會造成一些有益菌含量減少，從而重新塑造土壤的微生態(tài)系統(tǒng)，間接改良土壤，增強植株長勢，并減輕灰霉病等土傳病害的發(fā)生程度［22］。

馬建華等報道，在土壤中施入深綠木霉后細菌增長速度緩慢，而真菌數(shù)量顯著降低［23］。古麗君等研究發(fā)現(xiàn)，施入深綠木霉17 d后，真菌的數(shù)量比對照減少了4×103CFU/g，土壤中細菌的數(shù)量增加了1.27×1010CFU/g，放線菌數(shù)量沒有明顯變化［24］。另有報道顯示，木霉菌和假單胞菌屬可以協(xié)同作用，從而提高生防效果［25］。毛殼菌屬是優(yōu)良的生防菌，但木霉菌施用后會造成其數(shù)量下降，已有報道顯示兩者互相拮抗［19］。

有關木霉菌在土壤中存活時間的問題，當前研究結(jié)果不一，康萍芝等研究發(fā)現(xiàn)，施用木霉菌后11 d，木霉菌含量達到高峰，之后開始降低，55 d后土壤中幾乎檢測不到木霉菌［26］。杜嬋娟等發(fā)現(xiàn)，施用木霉菌后35 d，木霉菌含量達到高峰，之后開始下降［27］。古麗君等發(fā)現(xiàn)，木霉在施入25 d時，相對含量達到最低值［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，施用木霉制劑21 d后根際土壤中木霉菌含量已經(jīng)很低，其原因有待進一步研究。

表4 細菌Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計

土壤微生物多樣性是衡量土壤健康與否的重要指標。木霉菌的施用會改變土壤中的微生態(tài)系統(tǒng)，往往使一些土傳病害真菌種類和數(shù)量減少，而土壤中有許多真菌往往是重要的病原菌［28］，從而使土壤有益菌和病原菌保持一種動態(tài)平衡，達到抑制病害發(fā)生和促進作物生長的目的。

表5 真菌Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計

表6 木霉制劑對草莓生長和灰霉病發(fā)生的影響(施藥后50 d)