臧勝芹，陳曉勇，楊 凌，孫洪新，敦偉濤，梁瑞圓

(1.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北保定071000;2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲056038)

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)具有分子量小、進化速度快、母性遺傳等特點，因而mtDNA是研究分子進化的重要材料［1－2］。mtDNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成均依賴于核基因編碼的各類蛋白質(zhì)因子的調(diào)控［3］。細胞色素 b(cytochrome b，Cytb)是由mtDNA 13個多肽編碼基因之一，編碼產(chǎn)物為線粒體氧化磷酸化系統(tǒng)復(fù)合體Ⅲ組成之一，也是其中唯一由線粒體基因組編碼的蛋白質(zhì)［4］，是線粒體呼吸鏈上進行電子傳遞的細胞色素之一。細胞色素b的結(jié)構(gòu)特征是都以血紅素b作為輔基而且并不通過卟啉環(huán)邊基與蛋白鏈共價結(jié)合。研究得比較多的只有細胞色素b5(Cytb5)，它是一種膜蛋白質(zhì)。根據(jù)晶體X射線分析推出，肽鏈組裝成一個桶狀構(gòu)象把血紅素部分盛在“桶”中:幾片β片組成桶底，4個短的α螺旋(α1、α3、α4及 α5)構(gòu)成四壁［5］。Cytb 基因廣泛應(yīng)用于分子進化和系統(tǒng)發(fā)育研究，但有關(guān)綿羊Cytb基因編碼產(chǎn)物的研究很少。

為此，本研究通過測定湖羊Cytb基因CDS區(qū)序列，利用生物信息學(xué)方法，進行不同物種Cytb基因系統(tǒng)發(fā)育分析，對綿羊Cytb基因CDS區(qū)序列蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)及多參數(shù)預(yù)測、蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽預(yù)測、亞細胞定位和蛋白質(zhì)磷酸化、功能結(jié)構(gòu)域、三級結(jié)構(gòu)等進行分析，旨在為綿羊Cytb基因結(jié)構(gòu)與功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 Cytb基因序列來源

采集湖羊血液，提取DNA，參照文獻［6］合成引物擴增Cytb基因，將PCR產(chǎn)物測序獲得該基因序列。具體如下:上游引物:5'－GTCATCATCATTCTCACATGGAATC－3';下游引物:5'－CTCCTTCTCTGGTTTACAAGACCAG－3'。產(chǎn)物序列長度1 272 bp。由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系 30 μL:DNA 2.4 μL，10 × PCR Buffer 3 μL，dNTP(10 mmol/L)0.6 μL，上、下游引物(10 mmol/L)1.2 μL，Taq DNA Polymerase(5 U/μL)0.18 μL，ddH2O 21.42 μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性20 s，退火30 s，72℃延伸90 s，35個循環(huán);72℃延伸7 min。將擴增產(chǎn)物使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，120 V電泳35 min，使用凝膠成像儀檢測結(jié)果后，送上海生工生物工程有限公司進行雙向測序。并利用DNAman軟件對測得的湖羊Cytb基因進行翻譯獲得氨基酸序列。

此外，從NCBI網(wǎng)站的GenBank下載山羊、家牛、野豬、家犬、家馬、小家鼠、家貓、黑猩猩、大猩猩、人、原雞、斑馬魚等12個物種31條相似度較高的(一般為80%以上)Cytb基因CDS及其對應(yīng)的氨基酸序列(表1)。

1.2 分析方法

使用 NCBI網(wǎng)站中的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)查找開放閱讀框功能，利用 BioEdit Sequence Alignment Editor對32條核苷酸序列和與之對應(yīng)的32條氨基酸序列進行Fas格式轉(zhuǎn)換，利用NCBI網(wǎng)站Blast軟件進行核苷酸和氨基酸的同源性比對分析;利用Clustal X［7］和MEGA 6.0［8］軟件的鄰接法(neighboe － joiningmethod，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹;利用在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)以及DNAStar里的Protean分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì);利用JPred4在線軟件預(yù)測二級結(jié)構(gòu);利用DNAStar程序包里Protean軟件分析親水性、柔韌性、抗原指數(shù)和氨基酸表面可及性等參數(shù);利用 TMHMM 在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)分析;利用SignalP在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP － 4.0/)進行蛋白質(zhì)信號肽分析;利用 PSORT進行亞細胞定位分析;利用NetPhos 2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對Cytb基因編碼蛋白質(zhì)進行磷酸化位點預(yù)測;利用SWISSMODEL預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。

表1 12個物種的Cytb基因序列來源

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊Cytb基因開放閱讀框分析

通過ORF Finder分析表明，綿羊Cytb基因的ORF長度為1 140 bp，編碼379個氨基酸。

2.2 綿羊Cytb基因序列同源性及分子進化分析

通過NCBI進行同源性在線分析，湖羊、人、山羊、家牛、斑馬魚、家馬、家貓、原雞、大猩猩、小家鼠、黑猩猩、野豬和家犬的13個物種Cytb基因序列以及氨基酸序列進行比對，結(jié)果顯示，湖羊與山羊的相似性最高，其次是家牛，最后與原雞和斑馬魚一致性最低(表2)。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，湖羊和山羊親緣關(guān)系最為接近，其次是家牛，與原雞、斑馬魚等親緣關(guān)系較遠(圖1)。這與核苷酸一致性分析一致，符合物種進化規(guī)律。

2.3 綿羊Cytb基因編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 理化性質(zhì)分析 綿羊Cytb基因編碼蛋白質(zhì)由379個氨基酸殘基組成，其分子式為C3583H6028N1140O1451S324分子量為98.68 ku，理論等電點(pI)為5.0，說明該蛋白質(zhì)為酸性蛋白質(zhì)。其不穩(wěn)定系數(shù)為64.20，說明該蛋白質(zhì)為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，且預(yù)計在體外哺乳動物的網(wǎng)織紅細胞內(nèi)半衰期為4.4 h，在酵母體內(nèi)的半衰期＞20 h，在大腸桿菌體內(nèi)＞10 h，脂溶指數(shù)為31.49，總平均疏水指數(shù)1.035，屬于疏水蛋白質(zhì)。含有20種常見氨基酸殘基(圖2)，其中Leu(13.98%)含量最高，其次Ile(11.87%)含量較高。帶負電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu=0)等于帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys=0)。其摩爾消光系數(shù)為 88 850 L/(mol·cm)，1A(280)=0.48 mg/mL，等電點是 7.52，pH 值為 7 時，帶電量為 1.78。

表2 綿羊Cytb基因核苷酸和氨基酸序列與其他動物的一致性分析

2.3.2 Cytb結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)及多參數(shù)分析 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)分子中多肽鏈本身的折疊方式，蛋白質(zhì)分子的多肽鏈一般是部分卷曲盤旋成螺旋狀(α－螺旋結(jié)構(gòu))，或折疊成片層狀(β－折疊結(jié)構(gòu))，或以不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)存在于生物體內(nèi)［9］。

Gamier_Robson方法是通過計算特定氨基酸殘基在特定結(jié)構(gòu)內(nèi)部的可能性來預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)的。用該方法預(yù)測Cytb結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它有α螺旋形成，同時有許多β折疊存在，且分布比較均勻，在各β折疊單元之間存在長短不一的轉(zhuǎn)角(圖3)。該方法預(yù)測的結(jié)果還顯示，在該蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)有一些α螺旋結(jié)構(gòu)形成。

Chou_Fasman方法是通過序列氨基酸殘基的晶體結(jié)構(gòu)來預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，用該方法預(yù)測Cytb結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它有α螺旋結(jié)構(gòu)形成，其位置分別在第His 8－Val 14、lys 172－Glu 202、Gln 312－Met 316和 Gly351－Trp379區(qū)段(圖3)。相應(yīng)地，用該方法預(yù)測的β折疊和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)就較少且主要處于該蛋白質(zhì)的兩端。

組成Cytb蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的α螺旋(HELIX，H)、β折疊(STRAND，E)、無 規(guī) 卷 曲 (LOOP，L) 的 比 例 為64.91 ∶0.79 ∶34.30(圖4)。

Cytb結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的親水性分析:用Kyte_Doolittle方法對Cytb結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的親水性進行了分析。結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)存在較少的親水性區(qū)域，但其中親水性較高的區(qū)域主要集中在:Glu 202－Thr 225、Leu 249－Glu 271和 His 308－Arg 318提示該區(qū)域暴露于表面的幾率較大，作為抗原表位的可能性也最大(圖5)。

Cytb結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的表面可能性分析:在表面可能性較大的區(qū)域主要是 Ile 4－Met 11、His 32－Thr 60、Thr 203－Lys 227、Leu 249－Glu 271和Thr 309－Met 315區(qū)段，其他部位展示的可能性較小(圖5)。

Cytb結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)骨架區(qū)的柔韌性分析:含有一些的柔韌性區(qū)域，且分布比較均勻，提示該蛋白質(zhì)肽段有一定的柔韌性，可以發(fā)生扭曲、折疊，能形成比較豐富的二級結(jié)構(gòu)(圖5)。

Cytb結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)B細胞抗原表位的預(yù)測分析:通過聯(lián)合以上蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測方法分析Cytb結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)潛在的蛋白質(zhì)抗原決定簇，結(jié)果顯示結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)含有一些抗原指數(shù)較高的區(qū)域，其中以羥基端的指數(shù)性最高，所跨區(qū)域也最大(Asp 248－Glu 271)，提示該區(qū)段含有潛在優(yōu)勢抗原表位，其他一些區(qū)段也可能含有一些潛在的抗原表位，如，Thr 203－Lys 227等，這些區(qū)域的抗原指數(shù)也比較高，蛋白質(zhì)抗原指數(shù)較高的區(qū)域與其親水性較高區(qū)域的分布較為一致，這些區(qū)域可能包含潛在優(yōu)勢的抗原表位(圖5)。

2.3.3 蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽分析 從圖6可以看出，Cytb蛋白質(zhì)共存在9個典型的跨膜螺旋區(qū)，氨基酸序號分別為33 －55、76－98、113－135、140－158、178 －200、229 －251、288－310、323－340和350－372。由此可推測，綿羊Cytb基因CDS區(qū)所編碼的蛋白質(zhì)為跨膜蛋白質(zhì)，提示它可能作為膜受體起作用，也可能是定位在膜上的錨定蛋白質(zhì)或離子通道蛋白質(zhì)。

從圖7可以看出，Cytb蛋白質(zhì)的C、Y和S值的計算結(jié)果不具備信號肽的要求，表明綿羊Cytb蛋白質(zhì)不存在信號肽故該蛋白質(zhì)為非分泌蛋白質(zhì)。

2.3.4 亞細胞定位和蛋白質(zhì)磷酸化分析 亞細胞定位可以明確某種蛋白質(zhì)或表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的具體存在部位。經(jīng)亞細胞定位分析表明，該序列主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(77.8%)、細胞核(11.1%)、線粒體(11.1%)內(nèi)發(fā)揮其生物學(xué)作用。蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的重要機制。該蛋白質(zhì)經(jīng)磷酸化分析顯示(圖8)，綿羊Cytb蛋白質(zhì)有較多的蘇氨酸(Thr)以及絲氨酸(Ser)磷酸化位點和相對較少的酪氨酸(Tyr)磷酸化位點。

2.3.5 高級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析 利用SWISS－MODEL預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果(圖9)顯示，綿羊Cytb蛋白質(zhì)序列與Blast數(shù)據(jù)庫中5j4z.53.A模板序列相似性高達61%，該蛋白質(zhì)存在較多的扭曲，結(jié)構(gòu)較為豐富，該結(jié)果同時也表明了綿羊Cytb由α－螺旋、β－折疊和無規(guī)則卷曲組成，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測一致。而這些結(jié)構(gòu)對其生物學(xué)功能的發(fā)揮有重要作用。

3 討論

在線粒體DNA(mtDNA)的13個蛋白質(zhì)編碼基因中，Cytb的結(jié)構(gòu)功能最為清楚［10－11］。Cytb主要存在于內(nèi)膜磷脂中，在線粒體蛋白質(zhì)編碼基因中有著十分重要的作用，在氧化磷酸化過程中作為電子傳遞的重要媒介，其自身可以在線粒體內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄和翻譯。Cytb基因的進化速度相對來說比較適中，通常被人們用來研究種內(nèi)、近緣種間以及種間親緣關(guān)系，成為一種重要的區(qū)分手段［12］。在對不同物種同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析可知，湖羊與山羊親緣關(guān)系最近，其次是與牛親緣關(guān)系最近，其中偶蹄目最先聚為1支，再與靈長類動物聚在一起，最后與原雞、斑馬魚等聚在一起。綿羊Cytb基因共編碼379個氨基酸。

常見的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)有α－螺旋、β－折疊、轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等。綿羊的Cytb基因編碼蛋白質(zhì)以α－螺旋和無規(guī)則卷曲為主。蛋白質(zhì)分子構(gòu)象主要靠非共價鍵維持，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定在很大程度上有賴于分子內(nèi)的疏水作用，從各種因素的作用來看，疏水作用是非常重要的［13］。經(jīng)分析綿羊Cytb基因編碼蛋白質(zhì)為酸性、不穩(wěn)定性疏水蛋白質(zhì)。一般信號肽位于分泌蛋白的N端，通過判斷蛋白質(zhì)是否含有信號肽部分，可以初步推測該蛋白質(zhì)是否為分泌蛋白［14］，結(jié)果分析表明，Cytb蛋白質(zhì)既不存在信號肽，也不是分泌蛋白質(zhì)。綿羊Cytb基因編碼蛋白質(zhì)有9個跨膜結(jié)構(gòu)域，這與劉安芳等對家鵝線粒體細胞色素b跨膜螺旋結(jié)構(gòu)分析得出的結(jié)果［15］一致。Cytb主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核、線粒體內(nèi)發(fā)揮其生物學(xué)作用，與線粒體DNA的各種功能和調(diào)節(jié)有著密切的關(guān)系。蛋白質(zhì)磷酸化的表達直接影響蛋白質(zhì)活力和功能的調(diào)節(jié)，是最重要的機制，綿羊Cytb蛋白質(zhì)的蘇氨酸和絲氨酸磷酸化位點比較多，酪氨酸的磷酸化位點相對較少，蘇氨酸和絲氨酸磷酸化的主要作用是激活蛋白質(zhì)的活力，結(jié)果表明該蛋白質(zhì)酶活力較強［16］。