蔣燕明，彭 歡，唐 赟，陳清嬋

(荊楚理工學院生物工程學院，湖北荊門448000)

柑橘是我國水果產(chǎn)量第二的水果種類[1]，由于柑橘皮占果實重量的25%[2]，所以我國的柑橘經(jīng)食用和加工后會產(chǎn)生大量的柑橘皮。這些柑橘皮除了一小部分被曬干制成中藥陳皮或陳皮蜜餞等產(chǎn)品外,絕大部分都成為生產(chǎn)廢料或生活垃圾而被丟棄,不僅會因霉爛變質(zhì)而污染環(huán)境,而且也是一種資源的極大浪費[3]。實際上，橘皮營養(yǎng)豐富，富含類胡蘿卜素，黃酮類化合物，Vc、VE，糖類和K、Mg、Ca、P等多種微量元素[4]，具有開胃通氣、化痰鎮(zhèn)咳、止吐解酒等作用，實屬一種廉價的營養(yǎng)保健食品。橘皮醬油[5]、橘皮果醋[6-7]、橘皮果醬[8]等產(chǎn)品的研究已有報道，但帶橘皮發(fā)酵果酒的報道還鮮有報道。橘子酒的釀造普遍是以果肉榨汁為原料，橘皮直接丟棄而其中的營養(yǎng)價值沒有得到利用。為此，本實驗將橘皮進行處理，與果肉一同打漿，通過發(fā)酵將果皮及果實中的各種營養(yǎng)成分、香氣和色澤都融入到酒液中，從而使橘子酒香味濃郁、顏色美觀，又有豐富的營養(yǎng)價值，同時為橘皮的深度開發(fā)利用提供了一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

橘子，湖北荊門漳河產(chǎn)；白砂糖，食用，市售；菌種，從橘皮中篩選的酵母菌；亞硫酸，天津市福晨化學試劑廠（分析純）；硝酸鋁，天津市福晨化學試劑廠（分析純)；亞硝酸鈉，天津市福晨化學試劑廠（分析純)；鄰苯二甲酸氫鉀，天津市化學試劑一廠（分析純)；氫氧化鈉，武漢市洪山中南化工試劑有限公司（分析純)；95%vol乙醇，武漢市洪山中南化工試劑有限公司；蘆丁，北京索萊寶科技有限公司（純度95%)；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基），青島高科因海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺，薊州凈化；紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；101-1型電熱恒溫干燥箱，北京科偉永興儀器有限公司；YXQ-LS-100S11立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程（見圖1）

1.3.2 菌種的分離、純化及篩選

（1）酵母的分離、純化

選取1個新鮮無病蟲害的橘子，在自然環(huán)境（室內(nèi)）放置14 d，從其表面挑取橘皮，制得菌懸液，在PDA培養(yǎng)基上，30℃下平板培養(yǎng)3 d。觀察菌落情況，然后對菌體進行鏡檢，分離出單個菌落，逐步進行分離、純化[9]。取合適的菌體反復進行平板培養(yǎng)、分離、觀察、鏡檢，將適宜菌株轉(zhuǎn)移至試管斜面PDA培養(yǎng)基，以30℃進行增殖培養(yǎng)，3 d時轉(zhuǎn)移到4℃冰箱中保藏備用[10]。

圖1 橘子酒發(fā)酵流程圖

表1 酒液評分標準[13]

（2）菌落形態(tài)學鑒定

參照《真菌鑒定手冊》[11]和《酵母菌的特征與鑒定手冊》[12]，對酵母進行形態(tài)學鑒定。

（3）菌種液制備

從斜面培養(yǎng)基上取1環(huán)活化菌種接入50 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，水1000 mL，121℃下滅菌15 min）30℃培養(yǎng)3 d。菌種液酵母菌濃度達到3.3×107cfu/mL。

（4）菌種的篩選

將菌種分別加入帶皮橘汁中，在30℃下發(fā)酵5 d。將發(fā)酵好的橘子酒給6位師生進行感官評定，感官評分標準見表1，滿分100分。取6位成員評分的平均值為最終得分，通過最終得分篩選菌種。

1.3.3 發(fā)酵工藝單因素實驗

(1)帶皮橘汁的制備

選擇成熟無病蟲害的新鮮橘子，剝下橘皮清洗，并將橘皮于95℃以上水中燙2～3 min[6]。橘子分瓣，橘皮和橘子汁一起打漿，皮和果肉比例約為1∶5。向橘子果漿中加入水，比例為水∶汁=1∶3，得到待發(fā)酵橘子液。

(2)糖度對發(fā)酵的影響

調(diào)整混合汁的糖度以提升酒精度，使糖度(°Bx)分別為12、14、16、18、20。發(fā)酵條件為SO2添加量為60 mg/L，酵母添加量為0.3%，發(fā)酵時間為5 d，溫度為30℃。發(fā)酵結(jié)束后，測定糖度、酒精度、黃酮含量。

(3)SO2添加量對發(fā)酵的影響

向混合橘子汁中添加亞硫酸，使SO2添加量分別為20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L。發(fā)酵條件為糖度16°Bx，酵母添加量為0.3%，發(fā)酵時間為5 d，溫度為30℃。發(fā)酵結(jié)束后測定糖度、酒精度、黃酮含量。

(4)酵母接種量對發(fā)酵的影響

向混合橘子汁中添加選育的酵母菌，添加量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%。發(fā)酵條件為發(fā)酵條件為糖度16°Bx，SO2添加量為60 mg/L，發(fā)酵時間為5 d，溫度為30℃。發(fā)酵結(jié)束后測定糖度、酒精度、黃酮含量。

(5)發(fā)酵溫度對發(fā)酵的影響

發(fā)酵溫度（℃）設(shè)為18、22、26、30、34。發(fā)酵條件為糖度16 °Bx，SO2添加量為60 mg/L，酵母添加量為0.3%，發(fā)酵時間為5 d。發(fā)酵結(jié)束后測定糖度、酒精度、黃酮含量。

1.3.4 發(fā)酵工藝正交試驗設(shè)計

選取糖度、SO2添加量、酵母添加量、發(fā)酵溫度4個因素及其3個水平進行4因素3水平正交試驗，以最終的酒精度，感官評分為評價指標，對實驗結(jié)果進行方差分析，得到最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件。感官評分標準見表1，正交試驗因素與水平見表2。

表2 正交試驗因素與水平

1.3.5 測試指標與方法

糖度：手持糖度計法。

酒精度：蒸餾法。用容量瓶取100 mL酒樣于500 mL蒸餾瓶中，用50 mL水洗容量瓶后并入蒸餾瓶中，收集餾出液100 mL，冷卻后用酒精計測量并按20℃條件下的值校正。

黃酮含量：鋁鹽分光光度法。標準曲線見圖2。

圖2 黃酮含量標準曲線

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗指標測定3次，取平均值；試驗數(shù)據(jù)用Excel軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌種分離、純化及篩選結(jié)果

反復進行多次分離、純化，得到了符合酵母特征的初篩酵母菌2株，分別命名為JP-1、JP-2。2株菌株在PDA培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)3 d后，觀察其菌落形態(tài)，酵母的菌落及個體形態(tài)結(jié)果，分別用JP-1、JP-2發(fā)酵的帶皮橘子酒的感官評定結(jié)果見表3。

表3 酵母的菌落及個體形態(tài)

由感官評定結(jié)果選擇菌株JP-1作為發(fā)酵菌株。

2.2 發(fā)酵工藝單因素實驗結(jié)果

2.2.1 糖度對發(fā)酵的影響（圖3、圖4）

由圖3、圖4可知，酒精度隨著原液中初始糖度的增加而升高，在糖度為20°Bx時，達到最大，為8.3%vol，因其可轉(zhuǎn)化成酒精的糖增多了。隨著初始糖度的增加，殘?zhí)呛恳灿兴黾?，原液初始糖度?0°Bx時，達到最大，為6.9°Bx。黃酮含量也隨著初始糖度的增加而增加，最大為0.215 mg/mL。這是可能是由于酒精濃度的增加，溶解在酒液中的黃酮含量也隨之增加[14]。

圖3 初始糖度對酒液中糖度和酒精度的影響

圖4 初始糖度對黃酮含量的影響

2.2.2 SO2添加量對發(fā)酵的影響（圖5、圖6）

圖5 SO2添加量對糖度和酒精度的影響

圖6 SO2添加量對黃酮含量的影響

由圖5、圖6可知，隨著SO2添加量的增加，酒精度先增大后減小，酒精度在SO2添加量為80 mg/L時，達到最大值，為6.3%vol。這是由于SO2添加量的增大，抑制了雜菌的生長[15]，為酵母菌的繁殖創(chuàng)造了有利條件，從而使酒精度升高，同時SO2添加量過量時，也會抑制酵母菌的生長，所以酒精度又下降。黃酮含量與酒精濃度相關(guān)，在80 mg/L時達到了最大值，為0.320 mg/mL。

2.2.3 酵母接種量對發(fā)酵的影響（圖7、圖8）

圖7 酵母添加量對糖度和酒精度的影響

圖8 酵母添加量對黃酮含量的影響

由圖7、圖8可知，酵母接種量是影響乙醇發(fā)酵的重要因素之一，在不同的接種量條件下，酵母利用各種發(fā)酵性物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酒精的量是不同的[16]。隨著酵母添加量的增加，酒精度先升后降，在酵母添加量為0.3%時，達到最大，為8.3%vol。這是由于酵母添加量增大，其繁殖能力增強，產(chǎn)酒精量多，而酵母量過大時，繁殖競爭力增大，代謝產(chǎn)物過多反而抑制了其生長發(fā)酵。酒液中的糖度依然與酒精度呈負相關(guān)。黃酮含量隨著酵母添加量的增加先升高后降低，在酵母添加量為0.3%時，達到最大為0.292 mg/mL。一方面是因為酒精體積分數(shù)的增加酒液中溶解的黃酮含量增加，另一方面是由于溶液中的酵母增加，其代謝產(chǎn)生的丙酮酸、乙醛等與黃酮產(chǎn)生一些大分子衍生物，致使黃酮含量下降。

2.3.4 發(fā)酵溫度對發(fā)酵的影響（圖9、圖10）

圖9 發(fā)酵溫度對糖度和酒精度的影響

圖10 發(fā)酵溫度對黃酮含量的影響

由圖9、圖10可知，發(fā)酵溫度對發(fā)酵結(jié)果的影響較大，發(fā)酵溫度為18℃時酒精度最低，為2.7%vol，在30℃時達到最高為7.7%vol。這是因為在18℃時的酵母菌繁殖能力弱，產(chǎn)酒精能力低，在30℃時所用酵母菌適合生長繁殖，產(chǎn)酒精能力強。糖度與酒精度呈負相關(guān)。黃酮含量與酒精濃度呈正相關(guān)，在30℃時達最大值0.308 mg/mL。

2.3 發(fā)酵工藝的正交試驗結(jié)果

2.3.1 正交試驗方案及結(jié)果

為確定最佳發(fā)酵條件，在單因素的基礎(chǔ)上，以糖度、SO2添加量、接種量、發(fā)酵溫度為因素設(shè)計L9（34）正交試驗，以酒精度和感官綜合評分為評價標準，正交試驗結(jié)果見表4、表5。

表4 發(fā)酵工藝因素正交試驗結(jié)果

表5 發(fā)酵工藝因素正交試驗指標分析

由表5可知，以酒精度為指標的分析中，極差RA＞RC＞RB＞RD，所以因素主次為A＞C＞B＞D，即初始糖度＞接種量＞SO2添加量。發(fā)酵溫度又因為酒精度越大越好，取各因素最大K值所對應的水平，即為 A3B3C2D2，即糖度 20 °Bx，SO2添加量為100 mg/mL，酵母添加量為0.3%，發(fā)酵溫度為30℃。

以感官評分為指標的分析中，極差RD＞RC＞RA＞RB，所以因素主次為D＞C＞A＞B，即發(fā)酵溫度＞接種量＞初始糖度＞SO2添加量。綜合感官評分結(jié)果，取各因素最大K值所對應的水平，即為A3B3C3D2，即糖度20 °Bx，SO2添加量為100 mg/mL，酵母添加量為0.4%，發(fā)酵溫度為30℃。

在以上指標分析結(jié)果中，除了酵母添加量的水平取值不同，其他因素水平選取相同。而酵母添加量在兩個指標分析中所占主次地位相同，所以需要進行驗證實驗。

2.3.2 正交試驗優(yōu)化結(jié)果驗證（表6）

表6 驗證試驗結(jié)果

由表6可知，A3B3C2D2和A3B3C3D2方案所得的果酒的品質(zhì)都較好,酒精度含量高,感官評價良好,且分數(shù)相差不大。因此,考慮經(jīng)濟因素,選擇A3B3C2D2為帶皮橘子酒發(fā)酵最優(yōu)方案，即加水比例為1∶3，糖度20 °Bx，SO2添加量為100 mg/mL，酵母添加量為0.3%，發(fā)酵時間為6 d，發(fā)酵溫度為30℃。測得其黃酮含量為0.330 mg/mL。

3 結(jié)論

經(jīng)單因素和正交試驗得出，帶皮橘子酒發(fā)酵最佳工藝為：糖度為20 °Bx，SO2添加量為100 mg/L，酵母添加量為0.3%，發(fā)酵時間為5 d，發(fā)酵溫度為30℃。酒精度達到9.4%vol，黃酮含量為0.330 mg/mL。本工藝方案釀造的柑橘果酒保留了橘子的風味和營養(yǎng)價值，同時添加了橘皮中特有的風味和營養(yǎng)物質(zhì)，使成品清香怡人，具有良好的營養(yǎng)保健價值。