陳巧真，孫敏

（山東省濟寧市傳染病醫(yī)院肝病科，山東 濟寧 272031）

病毒性肝炎、艾滋病等病毒性疾病是嚴重的全球性公共衛(wèi)生問題，也是孕婦黃疸和妊娠并發(fā)癥的常見原因［1］。此外，受感染的母親可以將病毒傳染給胎兒或新生兒，這可能增加疾病負擔并且降低生活質量。孕婦接受抗逆轉錄病毒療法可以迅速和完全抑制母體病毒的RNA水平，以防止病毒通過母嬰傳播給胎兒和新生兒，并可以維持產婦的健康［2-4］。

核苷類逆轉錄酶抑制劑替諾福韋，因其良好的有效性和安全性，多年來已成為病毒感染者最常用的抗病毒藥物之一［5］。然而到目前為止，還沒有關于孕中期大鼠應用替諾福韋對子代鼠認知功能影響的相關報道。認知功能障礙的發(fā)生可能是由于神經發(fā)生過程受到抑制。孕中期胎鼠的腦內神經干細胞數(shù)量較多，暴露于藥物下很可能引起神經干細胞的損傷，藥物可能通過參與調節(jié)神經干細胞的增殖來影響神經系統(tǒng)發(fā)育［6-8］。Wnt信號通路被激活后，可以抑制GSK-3β的活性，使β-catenin在細胞質內大量積累，從而促進神經干細胞的增殖［9］。因此，本研究的目的是研究替諾福韋作用孕中期大鼠后對子代鼠認知功能以及Wnt信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物模型的建立：將24只Wistar大鼠 （山東省濟寧市傳染病醫(yī)院實驗動物中心提供） 按隨機數(shù)字表隨機分成3組，每組8只。在大鼠妊娠12～21 d時給予處置。對照組給予生理鹽水肌注10 d，低濃度替諾福韋組按照2.25 mg·kg-1·d-1注射替諾福韋，高濃度替諾福韋組按照4.5 mg·kg-1·d-1注射替諾福韋。實驗經動物倫理委員會同意，實驗過程中對動物處理符合動物倫理學標準。

1.1.2 主要試劑：替諾福韋 （石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司） ，戊巴比妥鈉 （上海西唐生物公司） ，生理鹽水、RIPA、Trizol、氯仿、異丙醇、乙醇 （國藥制藥） 。GSK-3β、β-catenin、nestin和GAPDH抗體 （美國Santa公司） ，二抗 （北京中杉金橋生物技術有限公司） 。引物合成于金斯瑞生物公司。反轉錄試劑盒、SYBR試劑盒 （日本TaKaRa公司）。

1.2 方法

1.2.1 血氣分析：妊娠第22天，取大鼠動脈血做血氣分析。

1.2.2 Morris水迷宮實驗：子代鼠出生4周后，從每只孕鼠的子代鼠中隨機取出4只雄鼠，進行水迷宮測試。測試期間需保持實驗室內燈光昏暗、環(huán)境安靜、杜絕帶入食物及飲料，以避免氣味對實驗的干擾作用。實驗開始時間均為上午8：00，每次實驗結束后將大鼠擦干放回籠子，注意保暖。測試包括定位航行測試以及空間探索測試。

定位航行測試：分5 d進行，每日每只大鼠進行4輪測試，每輪測試時間設定為90 s，每輪測試間隔不小于30 min，以保證大鼠有充分的休息。每只大鼠隨機從每個象限的中點面壁投放入水桶，分析軟件自動記錄大鼠自投放入水到找到平臺并逗留于平臺上的時間，即逃避潛伏期。如果大鼠在規(guī)定的90 s內找不到平臺，計算機自動停止記錄，測試者將大鼠輕柔地引導至平臺，保證大鼠在平臺上停留30 s。

空間探索測試：第5天完成定位航行實驗后，移去水下平臺，選定和原平臺區(qū)域對應的象限中點為入水點，將大鼠面壁投放入水桶，分析系統(tǒng)自動記錄90 s內大鼠穿越原平臺所在區(qū)域的次數(shù)。

1.2.3 Western blotting：子代鼠出生4周后，頸椎脫位法處死子代鼠，取海馬組織0.1 g，加大約10倍濕重的RIPA裂解緩沖液，粉碎勻漿后，冰上裂解30 min，低溫高速離心，保留上清。定量后每個樣本取10 μg進行SDS-聚丙烯酰胺膠電泳、轉膜、脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜3次、一抗孵育4 ℃過夜、洗膜后二抗室溫震蕩孵育2 h，TBST洗膜后ECL發(fā)光。

1.2.4 實時PCR實驗：子代鼠出生4周后，頸椎脫位法處死子代鼠，取海馬組織0.1 g，加入1 mL Trizol裂解液裂解后，分別通過氯仿、異丙醇、乙醇等處理提取總RNA，反轉錄后進行實時PCR實驗，所用引物為GSK-3β，正義鏈5’-CCTTAACCTGGTGCTGGACT-3’，反義鏈 5’-AGCTCTGGTGCCCTGTAGTA-3’； β-catenin，正義鏈5’-CTACTTGTTCTGAGTGAA-3’，反義鏈5’-TG GAACCAGACAGAAAAGC-3’；nestin，正義鏈5’-GC CCTGACCACTCCAGTTTA-3’，反義鏈5’-GGAGTCC TGGATTTCCTTCC-3’；GAPDH，正義鏈5’- AGAAGG CTGGGGCTCATTTG-3’，反義鏈 5’-AGGGGCCATCC ACAGTCTTC-3’。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗組與對照組的比較采用完全隨機設計t檢驗，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 替諾福韋對孕鼠及子代大鼠體質量的影響

各組孕鼠在孕期第22天進行頸內動脈抽血監(jiān)測血氣分析，結果發(fā)現(xiàn)，低濃度替諾福韋組、高濃度替諾福韋組與對照組相比，pH、pO2、pCO2無統(tǒng)計學差異，見表1。對照組、低濃度替諾福韋組、高濃度替諾福韋組新生大鼠體質量分別為 （23.31±2.98） 、（24.32±1.61） 、 （25.01±1.23） g，低濃度替諾福韋組、高濃度替諾福韋組與對照組相比，體質量無統(tǒng)計學差異。

2.2 替諾福韋對子代大鼠認知功能的影響

定位航行測試結果顯示，與對照組相比，低濃度替諾福韋組子代大鼠各時間點逃避潛伏期時間的差異無統(tǒng)計學意義 （P ＞ 0.05） ，而高濃度替諾福韋組子代大鼠逃避潛伏期較對照組明顯延長，到達平臺前路程明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜ 0.05） ，見表2。

表1 各組血氣分析結果 （n = 8）Tab.1 Results of blood gas analysis in different groups （n = 8）

空間探索測試結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，低濃度替諾福韋組子代大鼠平臺穿越次數(shù)以及停留時間的差異無統(tǒng)計學意義 （P ＞ 0.05） ，而高濃度替諾福韋組子代大鼠平臺穿越次數(shù)及時間明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜ 0.05） ，見表2。

表2 替諾福韋對逃避潛伏期、平臺穿越次數(shù)及停留時間的影響Tab.2 Effect of tenofovir on escape latency，platform crossing times and residence time

2.3 替諾福韋對子代大鼠Wnt通路蛋白的影響

Wnt通路可以影響神經干細胞的增殖，也是與學習和記憶密切相關的通路。本研究應用Western blotting和 實 時PCR檢 測GSK-3β、β-catenin及nestin蛋白和mRNA水平的變化，結果發(fā)現(xiàn)低濃度替諾福韋組子代大鼠海馬組織內GSK-3β、β-catenin及nestin含量與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義 （P ＞ 0.05） ，高濃度替諾福韋組子代大鼠海馬組織內GSK-3β含量明顯高于對照組和低濃度替諾福韋組，β-catenin及nestin含量明顯低于對照組和低濃度替諾福韋組，差異均有統(tǒng)計學意義 （P ＜ 0.05） 。見圖1。

3 討論

母嬰傳播是各種病毒性疾病 （乙型肝炎、人類免疫缺陷病毒等） 患者或者病毒攜帶狀態(tài)的母親將病毒傳播給嬰兒的傳播方式。有統(tǒng)計學數(shù)據指出，我國人群中有近50%的HBsAg攜帶者可能是由母嬰傳播所致［8］。母嬰傳播分為3個階段：宮內傳播，懷孕時母體血液中的病毒經胎盤傳遞給嬰兒；產程傳播，分娩時、嬰兒出生過程中皮膚損傷或病毒通過破裂胎盤傳遞給嬰兒以及分娩后母親與胎兒親密接觸傳播；哺乳傳播。各種核苷酸逆轉錄酶 （西多福韋、阿德福韋、替諾福韋等） 的應用可以在備孕期及孕期降低病毒的含量，減少病毒母嬰傳播的機會［9］。

圖1 替諾福韋作用后GSK-3β、β-catenin及nestin蛋白和mRNA的表達水平Fig.1 Protein and mRNA expressions of GSK-3β，β-catenin，and nestin after treatment with tenofovir

替諾福韋是指南推薦的備孕期及孕期的抗病毒治療的藥物。使用替諾福韋可以大大地降低體內病毒量，使得宮內感染的可能性下降。研究［10-12］指出，替諾福韋的生物安全性高，肝腎毒性較小，但是目前國內針對替諾福韋在孕期應用安全性的研究較少。

有研究指出，孕鼠長期使用2.25 mg·kg-1·d-1的替諾福韋并不會影響母體及子代鼠P糖蛋白和乳腺癌耐藥蛋白等的表達，即其在孕期的應用相對安全。但是也有研究［13］指出替諾福韋會增加胎盤與子代鼠體質量的比值，可能會對子代鼠的健康情況造成影響。一項對17例HIV感染孕婦應用替諾福韋進行的調查研究［14］發(fā)現(xiàn)，應用12周替諾福韋可以在一定程度上改善患者的認知能力和神經心理測驗評估分數(shù)。在美國，一項有230名參與者的雙盲研究［15］結果也指出，替諾福韋的應用可以在不損傷患者神經功能、不影響患者認知能力的前提下，降低病毒的含量，減少病毒帶來的損傷。

本研究是首次在體應用孕-胎鼠模型，觀察孕中期相關劑量的替諾福韋暴露對子代鼠學習記憶功能以及神經干細胞增殖相關信號通路的影響。本研究結果顯示，孕中期接受低濃度替諾福韋并不會損害子代鼠的學習記憶功能。但在孕中期接受高濃度替諾福韋則明顯影響子代鼠的學習記憶功能，表現(xiàn)為水迷宮實驗中潛伏期延長、平臺活動時間以及穿越平臺次數(shù)減少。

許多研究［15］提示，齒狀回神經的發(fā)生在海馬相關學習記憶形成中至關重要。Wnt信號通路在發(fā)育期神經發(fā)生過程中扮演重要角色。β-catenin是Wnt信號通路的核心分子，在Wnt信號通路中處于中心位置。GSK-3β在整個中樞神經系統(tǒng)中都有表達，特別在海馬表達水平更高［16］。GSK-3β可磷酸化β-catenin，介導β-catenin的降解。Wnt信號通路被激活后，可以抑制GSK-3β的活性，使胞內β-catenin在細胞質內大量積累，從而促進神經干細胞的增殖。Wnt通路的激活也可以促進nestin蛋白這一神經干細胞特征性標志物的表達［17］。

本研究發(fā)現(xiàn)高濃度替諾福韋可以影響子代鼠的認知功能后，對Wnt通路的相關蛋白進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)孕期高濃度的替諾福韋很可能引起了子代鼠腦內GSK-3β水平升高，β-catenin水平降低，進而通過抑制Wnt/β-catenin通路抑制了神經干細胞的增殖，抑制了nestin的表達，從而損害了子代鼠的學習記憶功能。

雖然本研究對機制的探討較為淺顯，需要進一步的功能學實驗或者細胞水平的實驗進行驗證，但是仍然在一定程度上證明高濃度的替諾福韋可以抑制子代鼠的認知功能。

綜上所述，低濃度替諾福韋使用較為安全，但是高濃度的替諾福韋可以通過影響Wnt信號通路的激活抑制子代大鼠的認知功能。