趙軻，張永建，劉奇，徐迪，陳寶鈞

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院胸外科，武漢 430014）

肺癌是全球惡性腫瘤導(dǎo)致死亡的首要原因，每年超過100萬(wàn)患者死于肺癌［1-2］。肺癌分為小細(xì)胞肺癌 （small cell lung cancer，SCLC） 與非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC） ，其中NSCLC占85%左右［3］。 雖然近年來(lái)多種治療方法已經(jīng)運(yùn)用于NSCLC患者，但其5年的總生存率仍然較低 （僅為15%）［4］。因此，急待研究出更多新穎可靠的用來(lái)預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后的生物標(biāo)記物。

miRNAs 作為一種長(zhǎng)度約為19～24個(gè)核苷酸的小分子非編碼單鏈RNA，主要通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)，從而參與多種生理病理活動(dòng)，包括細(xì)胞的增殖、分化與凋亡等［5］。miR-107屬于miR-103/107家族，在多種癌癥中可被視為促癌因子［6］。研究［7-9］顯示，miR-107可通過調(diào)控相關(guān)靶點(diǎn)，如高遷徙率族蛋白A2 （high mobility group A2，HMGA2） 或原肌球蛋白1 （targeting tropomyosin 1，TPM1） ，促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化及遷徙，從而刺激骨肉瘤、肝細(xì)胞瘤等癌癥的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移。然而，miR-107的表達(dá)水平在NSCLC患者中的作用尚未完全明確，本研究旨在評(píng)估血漿miR-107的表達(dá)水平與NSCLC 患者臨床病理特征及預(yù)后的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2010年4月1日至2012年3月31日在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院胸外科入院確診為原發(fā)性NSCLC并接受手術(shù)治療的患者196例。所有NSCLC患者根據(jù)其臨床特征、影像學(xué)檢查和病理證實(shí)確診。有腫瘤及惡性血液疾病史或并發(fā)其他復(fù)雜肺部疾病，如慢性阻塞性肺疾病 （chronic obstructive pulmonary disease，COPD） 、肺部感染等的患者均被排除在外。本研究已獲得了華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有涉及的被測(cè)試者都已告知研究方案，并簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本來(lái)源

在術(shù)后且未開始其他輔助治療前 （包括化療、放療、免疫治療等） 采集NSCLC患者靜脈血，取血漿備用。此外，在術(shù)中腫瘤區(qū)域采集腫瘤組織樣本。

1.3 RNA提取方法與實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)

利用Trizol Reagent （日本TaKaRa公司） 抽提總RNA，并通過分光光度計(jì)來(lái)檢測(cè)RNA的濃度及純度。隨后，采用PrimerScript Real-time reagent kit （日本TaKaRa公司） 進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，運(yùn)用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（日本TaKaRa公司） 定量分析miRNA。所有的操作均嚴(yán)格按照制造商的操作說(shuō)明執(zhí)行。PCR反應(yīng)以U6作為內(nèi)參因子，采用2-△△Ct的方法計(jì)算血漿中miR-107的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 評(píng)估與隨訪

采集所有患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)、病理特征及臨床癥狀等相關(guān)信息。此外，所有患者的腫瘤分期根據(jù)第7版的美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)發(fā)布的癌癥分期手冊(cè)（AJCC7.0） 進(jìn)行評(píng)估。隨訪截止日期為2016年8月31日，中位隨訪時(shí)間為 56個(gè)月?？偵嫫?（overall survival，OS） 和無(wú)病生存期 （disease free survival，DFS）的時(shí)間分別是從手術(shù)日期至由任何原因引起的死亡之間的時(shí)間，以及手術(shù)時(shí)間開始到出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或由任何原因引起死亡之間的時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Spearman檢驗(yàn)分析miRNAs 表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性以及miR-107 分別在血漿和腫瘤組織樣本中的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier （K-M） 曲線和log-rank檢驗(yàn)分析miR-107 與 DFS 和OS 的關(guān)系。并進(jìn)一步采用單元、多元Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行評(píng)估m(xù)iR-107與DFS及OS的關(guān)系。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象基線信息

196例確診為NSCLC的患者中，男118例，女78例；平均年齡 （59.43±9.73） 歲；根據(jù)NSCLC的組織病理學(xué)分型標(biāo)準(zhǔn)，腺癌87例 （44.4%） 、鱗癌 96例（49.0%） 、其他13 例 （6.6 %） ；腫瘤大?。? cm 80例（40.8%） 、≤5 cm 116例 （59.2%） ；血漿miR-107表達(dá)水平為0.675 （0.445～0.918） ；腫瘤組織miR-107 表達(dá)水平為2.216 （1.387～2.816） 。見表1。

2.2 血漿miR-107與腫瘤組織miR-107表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)分析

Spearman檢驗(yàn)分析表明，miR-107在血漿和腫瘤組織中的表達(dá)水平均呈正相關(guān) （r = 0.465，P ＜ 0.001） ，見圖1。

2.3 血漿/腫瘤組織miR-107表達(dá)水平與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián)

在NSCLC患者中，血漿miR-107 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān) （r = 0.168，P = 0.018） ；腫瘤組織miR-107與病理分化 （r = 0.304，P ＜ 0.001） 、腫瘤大小 （r =0.230，P = 0.001） 、淋巴轉(zhuǎn)移 （r = 0.446，P ＜ 0.001） 以及 TNM分期 （r = 0.294，P ＜ 0.001） 正相關(guān)。見表2。

表1 基線信息Tab.1 Baseline characteristics

2.4 血漿和腫瘤組織miR-107表達(dá)水平與NSCLC患者DFS與OS的關(guān)聯(lián)

圖1 血漿和腫瘤組織miR-107表達(dá)水平關(guān)聯(lián)分析Fig.1 Correlation of miR-107 expression in plasma and tumor tissue

本研究中，196例NSCLC患者術(shù)后5年的DFS為13.6%，OS則為32.8%。根據(jù)血漿和組織miR-107的表達(dá)水平的中位值，將患者分為高表達(dá)組與低表達(dá)組。采用Kaplan-Meier曲線和log-rank檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)血漿miR-107 高表達(dá)患者的DFS （P = 0.002） 和OS （P ＜0.001） 與低表達(dá)組相比較差；在腫瘤組織樣本中，miR-107 高表達(dá)患者的DFS （P ＜ 0.001） 與OS （P ＜0.001） 與低表達(dá)組相比亦較差，見圖2。

表2 miR-107與NSCLC患者特征的關(guān)聯(lián)分析Tab.2 Correlation of miR-107 expression and clinicopathological features in patients with NSCLC

2.5 DFS與OS的預(yù)后因素分析

采用單元Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析NSCLC患者血漿和腫瘤組織中miRNA-107高表達(dá)量以及臨床病理特征分別對(duì)于患者DFS和OS的影響，發(fā)現(xiàn)血漿miR-107 （P = 0.003） 和腫瘤組織中miR-107 （P＜0.001） 高表達(dá)與患者差的DFS顯著相關(guān)，此外，低分化 （P = 0.003） 、腫瘤大小 （P = 0.024） 、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 （P ＜0.001） 及TNM分期 （P = 0.002） 也與患者短的DFS顯著相關(guān)。進(jìn)一步采用多元Cox回歸模型分析NSCLC患者DFS的預(yù)測(cè)因素，結(jié)果顯示，腫瘤組織中miR-107高表達(dá) （P ＜ 0.004） 和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 （P = 0.010） 是NSCLC患者較短的DFS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。見表3。

此外，單元Cox分析顯示，血漿miR-107高表達(dá)（P ＜ 0.001） 、 腫瘤組織miR-107高表達(dá) （P ＜ 0.001） 、低分化 （P = 0.008） 、腫瘤大小 （P = 0.001） 、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 （P ＜ 0.001） 、高的TNM分期 （P ＜ 0.001） 均能預(yù)測(cè)患者較差的OS。多元Cox分析結(jié)果表明，血漿miR-107高表達(dá) （P = 0.005） 、腫瘤組織miR-107高表達(dá) （P ＜0.001） 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 （P = 0.009） 是患者較差OS 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表4。

圖2 miR-107表達(dá)水平與NSCLC患者DFS與OS的關(guān)聯(lián)Fig.2 Correlation of miR-107 expression with DFS and OS in patients with NSCLC

表3 DFS的預(yù)后因素分析Tab.3 Analysis of prognostic factors for DFS

表4 OS的預(yù)后因素分析Tab.4 Analysis of prognostic factors for OS

3 討論

雖然組織活檢被視為目前評(píng)估腫瘤分期分型的首選方法，但其伴隨的感染或出血等并發(fā)癥仍讓一些患者難以承受。相對(duì)而言，血液樣本則容易獲得且更讓患者所接受［10］。因此，本研究采集了患者的血漿和組織樣本，評(píng)估了miR-107在血漿和腫瘤組織中表達(dá)量的相關(guān)性，結(jié)果顯示，NSCLC患者中miR-107在血漿和腫瘤組織中的表達(dá)水平呈正相關(guān)。

miR-107位于第10號(hào)染色體，在多種代謝活動(dòng)中具有差異性表達(dá)，包括脂肪生成、細(xì)胞周期阻滯以及神經(jīng)退行性疾病等［11］。miR-107的促癌作用在胃癌、乳腺癌及骨肉瘤等均得到了證實(shí)［7-8，12-13］。研究［9］表明，在肝癌組織中，有明顯上調(diào)的miR-107，其可通過靶向調(diào)控軸抑制蛋白2 （axis inhibition protein2，Axin2） 的表達(dá)水平，從而促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖；在胃癌組織中，過度表達(dá)的miR-107通過靶向調(diào)控大型腫瘤抑制因子2 （lager tumor suppressor，Lats2）的表達(dá)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和遷徙［14］；在乳腺癌組織中，上調(diào)的miR-107可通過靶向調(diào)節(jié)Dicer1基因，從而促進(jìn)上皮細(xì)胞到間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移［12，15］。此外，有研究［16］評(píng)估了miR-107與惡性腫瘤臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，其中胃癌患者的miR-107不僅與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤的階段相關(guān)，而且高表達(dá)miR-107患者的DFS和OS比低表達(dá)患者差。同時(shí)NSCLC中上調(diào)的miR-107通過靶向調(diào)控細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶8，增強(qiáng)了患者對(duì)順鉑的耐藥性，因此，miR-107可用來(lái)預(yù)測(cè)NSCLC患者對(duì)于化療的反應(yīng)［11］。

與上述研究結(jié)果趨勢(shì)相似，本研究發(fā)現(xiàn)，血漿miR-107 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，腫瘤組織miR-107與病理分化、腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移以及 TNM分期正相關(guān)，可能與miR-107靶向調(diào)控Axin2或Dicer1等基因的表達(dá)水平，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷徙作用有關(guān)［9，12］。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，血漿和腫瘤組織中miR-107高表達(dá)可預(yù)測(cè)患者較短的DFS和OS，多元Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型表明，血漿miR-107高表達(dá)可獨(dú)立預(yù)測(cè)患者較差的OS，腫瘤組織中miR-107高表達(dá)可獨(dú)立預(yù)測(cè)患者較短的DFS及OS，提示miR-107在NSCLC患者DFS和OS有潛在預(yù)測(cè)作用。這可能是由于miR-107通過刺激腫瘤細(xì)胞的增殖與遷徙，促進(jìn)惡性腫瘤的浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，繼而影響患者的預(yù)后情況。此外，miR-107可提高患者對(duì)順鉑等化療藥物的耐藥性，從而導(dǎo)致患者的不良預(yù)后［11，16］。

本研究仍有一些不足： （1） 本研究未納入TNM分期為Ⅳ期NSCLC患者，因此未能評(píng)估m(xù)iR-107對(duì)于Ⅳ期患者的預(yù)后作用； （2） 本研究的樣本量相對(duì)較小，可能導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)學(xué)效能相對(duì)大樣本量較小； （3）本研究未涉及miR-107在NSCLC中的具體機(jī)制。因此，今后進(jìn)一步的研究應(yīng)擴(kuò)大樣本容量并納入Ⅳ期NSCLC患者。

綜上所述，本研究表明循環(huán)miR-107可作為一種新穎可靠的生物標(biāo)記物，用于評(píng)估NSCLC患者的臨床病理特征和預(yù)后情況。