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        P16在宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ級組織中的表達(dá)及臨床意義

        2018-10-13 08:27:08賀桂芳趙婷婷卞美璐原亞莉楊文艷
        關(guān)鍵詞:陽性細(xì)胞宮頸癌陽性率

        張 媛 ,賀桂芳 ,馬 莉 ,趙婷婷 ,卞美璐 ,原亞莉 ,楊文艷

        (1.北京大學(xué) 醫(yī)學(xué)部,北京 100191;2.北京大學(xué) 中日友好臨床醫(yī)學(xué)院,北京 100029;3.中日友好醫(yī)院 婦產(chǎn)科,北京 100029;4.中日友好臨床研究所 “免疫炎性疾病”北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100029)

        宮頸癌發(fā)病率在全球女性腫瘤中位居第三位,在發(fā)展中國家位居第二位[1,2]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(world health organization,WHO)估算,全球每年約53萬女性發(fā)生宮頸癌,約27.5萬女性死于宮頸癌。宮頸癌在多數(shù)發(fā)展中國家,占女性腫瘤死因的第一位[3]。我國宮頸癌每年新發(fā)病例約為9.6萬例,占世界宮頸癌每年新發(fā)病例的18%,其中死亡病例約2.6萬[4]。在基線為CINⅠ的患者,p16INK4a陽性與陰性婦女相比,2年后進(jìn)展為高級別子宮頸病變的風(fēng)險(xiǎn)前者是后者8.25倍,表明p16INK4a的過度表達(dá)與宮頸病變程度相關(guān),低級別宮頸病變組織中p16INK4a過度表達(dá)能夠?qū)ζ湟院筮M(jìn)展為高級別宮頸病變具有預(yù)測能力[5]。對于CINⅡ具有進(jìn)展和退化的生物學(xué)行為,目前我國尚缺乏確切的方法判斷其預(yù)后轉(zhuǎn)歸。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測P16表達(dá)情況,分析P16蛋白表達(dá)與CINⅡ病變進(jìn)展的關(guān)系,為臨床采用合理的干預(yù)措施提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料來源

        選取2008年1月~2017年12月就診于中日友好醫(yī)院,經(jīng)術(shù)后病理報(bào)告確診為宮頸上皮內(nèi)瘤變(CINⅡ)患者的石蠟組織切片158例。正常宮頸石蠟組織切片40例?;颊呓M織的病理診斷均經(jīng)2位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師確診。

        1.2 試劑

        抗P16(E6H4)鼠單克隆抗體試劑、新型酶標(biāo)記物IgG聚合物(上海羅氏制藥有限公司)。二氮基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。采用Tris-HCl緩沖液來稀釋抗P16(E6H4)鼠單克隆抗體試劑。在此產(chǎn)品中沒有發(fā)現(xiàn)已知的非特異性抗體反應(yīng)性。

        1.3 檢測方法

        利用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行染色。結(jié)果判定:P16INK4A的免疫組織化學(xué)判定方法主要有兩個(gè)方面:表達(dá)強(qiáng)度和細(xì)胞中表達(dá)部位。陽性結(jié)果為黃色或棕黃色染色,表達(dá)部位是在胞漿和/或細(xì)胞核。表達(dá)強(qiáng)度參照KLEASR等[6]的半定量標(biāo)準(zhǔn),按照陽性細(xì)胞核所占比例及分布情況記錄如下:陰性(-):單個(gè)細(xì)胞染色,陽性細(xì)胞數(shù)<5%;弱陽性(+):散在的或小的細(xì)胞團(tuán)染色,陽性細(xì)胞數(shù)為5%-24%;陽性(++):片狀或簇狀細(xì)胞染色,陽性細(xì)胞數(shù)位25%-50%;強(qiáng)陽性:彌漫散的細(xì)胞染色,陽性細(xì)胞數(shù)>50%。

        HPV檢測:采用免疫組化技術(shù)法,通過發(fā)光放大微孔板中基因信號,對受檢標(biāo)本中HPV18,33,45等13種高危型HPV病毒進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果陰性:HPV-DNA負(fù)荷量<1.0pg/ml;陽性:HPV-DNA負(fù)荷量≥1.0pg/ml;其中HPVDNA負(fù)荷量=標(biāo)本相對發(fā)光單位/標(biāo)本陽性對照。

        LCT檢測:清潔宮頸表面黏液,將特制的宮頸細(xì)胞刷插入宮頸管內(nèi),順時(shí)針在宮頸內(nèi)旋轉(zhuǎn)5周后快速取出,注入細(xì)胞保存液中獲取細(xì)胞樣品,采用TBS系統(tǒng)檢測液基細(xì)胞。檢測結(jié)果陽性:ASCH、AGUS/ASCUS、HSIL、LSIL 出現(xiàn)異?;虿∽?。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS20.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,相關(guān)性分析比較患者的術(shù)后隨訪細(xì)胞學(xué)結(jié)果和P16的表達(dá)關(guān)系,再用秩和檢驗(yàn)來比較各組間的差異。

        2 結(jié)果

        2.1 宮頸標(biāo)本中P16生物標(biāo)記物表達(dá)情況

        宮頸標(biāo)本中P16生物標(biāo)記物過度表達(dá)表現(xiàn)為宮頸鱗狀上皮的基底層和基底旁層細(xì)胞的彌漫性連續(xù)性染色、伴有或不伴有淺表細(xì)胞層細(xì)胞染色,呈淡黃色至棕褐色,表達(dá)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)(見圖1,封底)。

        圖1 A.CINⅡ患者P16陽性表達(dá)。B.CINⅡ患者P16陰性表達(dá)。(100×)

        2.2 P16在正常組織與CINⅡ中陽性表達(dá)

        對40例正常宮頸組織和158例術(shù)后病理確診為CINⅡ患者的石蠟切片利用免疫組化原理進(jìn)行染色,觀察P16表達(dá)情況并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。表1示,CINⅡ患者宮頸組織中P16陽性表達(dá)率為55.7%,顯著高于正常宮頸組織中P16陽性表達(dá)率(7.5%,P<0.01)。

        2.3 P16陽性表達(dá)與HPV感染的關(guān)系

        對158例CINⅡ患者中進(jìn)行HPV感染與P16陽性表達(dá)關(guān)系的統(tǒng)計(jì)分析。隨機(jī)挑選22例P16陰性的患者中HPV陰性表達(dá)為18例,陰性表達(dá)率為82%;HPV陽性表達(dá)為4例,陽性率18%。隨機(jī)挑選40例P16陽性表達(dá)CINⅡ患者中進(jìn)行HPV感染的統(tǒng)計(jì)。HPV陰性表達(dá)為10例,陰性表達(dá)率為25%;HPV陽性表達(dá)30例,陽性率75%。P16陽性表達(dá)與HPV陽性和陰性比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表 2)。

        2.4 CINⅡ患者陽性表達(dá)術(shù)后隨訪結(jié)果

        表3示,在CINⅡ患者中隨機(jī)選取37例進(jìn)行術(shù)后隨訪,P16陽性患者超薄細(xì)胞檢測(LCT)陽性率72.72%,顯著高于P16陰性患者的LCT陽性率(15.79%,P<0.05)。

        表1 P16在正常組織與CINⅡ中陽性表達(dá)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果 n(%)

        表2 P16陽性表達(dá)與HPV感染的關(guān)系 n(%)

        表3 CINⅡ患者P16陽性表達(dá)術(shù)后隨訪結(jié)果 n(%)

        3 討論

        p16基因是一個(gè)多腫瘤抑制基因,主要作用在于能夠直接參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié),抑制細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶CDK4/CDK6的活性,阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入s期[7]。p16基因的失活將導(dǎo)致細(xì)胞周期失控,細(xì)胞異常增殖而癌變。該基因產(chǎn)物對CDK4的活性具有抑制作用,因而也稱為p16 INK4(inhibitor of CDK4)[8]。 P16 的高表達(dá)與宮頸癌有一定的相關(guān)性,在組織病理學(xué)中這一結(jié)論已經(jīng)得到證實(shí)[9]。因此P16免疫組化染色已被應(yīng)用于宮頸癌前病變的輔助診斷,以提高診斷的準(zhǔn)確率和可重復(fù)性。

        有關(guān)報(bào)道指出,P16在正常組織中表達(dá)率為2%,在CIN1中表達(dá)率為38%,在CIN2中表達(dá)率為68%,在CIN3中表達(dá)率為82%[10]。因此P16可以作為宮頸癌上皮內(nèi)瘤變的一個(gè)有效的分子指標(biāo)。本研究中,P16在正常宮頸組織中陽性率為7.5%;在CINⅡ患者中陽性率為55.7%。P16在正常組織和CINⅡ患者中陽性表達(dá)情況具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。進(jìn)一步證實(shí)了CINⅡ患者中P16表達(dá)呈顯著正相關(guān),說明P16的高表達(dá)促進(jìn)了宮頸病變的進(jìn)展。

        1977年ZurHausen發(fā)現(xiàn)宮頸癌發(fā)生的一個(gè)重要原因是HPV感染,研究表明由于HR-HPV的E7癌蛋白介導(dǎo)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白失活,P16蛋白強(qiáng)烈過度表達(dá)[11]。由于E7是HPV相關(guān)癌前病變和癌變中維持惡性表型的必要因素,因此P16過度表達(dá)與HR-HPV的致癌活性直接相關(guān),并被認(rèn)為是HPV感染轉(zhuǎn)化的標(biāo)記物。本研究中P16陽性表達(dá)CINⅡ患者中HPV陽性率為75%,陰性率為25%。P16陽性表達(dá)與HPV是否感染,兩者差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),進(jìn)一步證實(shí)了P16過度表達(dá)與HPV感染的致病有直接關(guān)系。

        Roelens等對p16INK4a免疫細(xì)胞化學(xué)染色與人乳頭瘤病毒基因檢測HC-Ⅱ?qū)SCUS和LSIL的分流能力做了薈萃分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),p16INK4a預(yù)測ASCUS和LSIL進(jìn)展為高級別子宮頸病變的敏感度分別為83.2%、83.8%,特異度分別為71.0%、65.7%,與HC-Ⅱ相比,兩者的敏感度相近,但前者的特異度較高[12]。而我國目前對于宮頸病變存在過度診治的現(xiàn)象,尤其對CINⅡ的患者;P16對于CIN的診斷有極好的指導(dǎo)作用,可以減少宮頸病變的過度診治。P16陰性的患者術(shù)后隨訪超薄細(xì)胞檢測(LCT)陰性表達(dá)率為84.21%;陽性表達(dá)率為15.79%。P16陽性患者進(jìn)行術(shù)后隨訪超薄細(xì)胞學(xué)檢測,陰性表達(dá)率為27.78%,陽性表達(dá)率為72.22%。術(shù)后隨訪超薄細(xì)胞學(xué)檢查與P16陽性和陰性表達(dá)兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)??梢?,P16陽性患者術(shù)后病情持續(xù)和進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)更高;P16陰性患者可以采取暫時(shí)觀察,以減少不必要的手術(shù)創(chuàng)傷。

        因此,我們認(rèn)為在CINⅡ級別病變中,P16陽性與陰性婦女對比,未來進(jìn)展為更高級別子宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)會明顯增加,因而P16蛋白可以作為有效的指標(biāo)指導(dǎo)CINⅡ級別病變的臨床治療。從而建議條件允許的情況下,陰道鏡同時(shí)行P16檢測,陰性表達(dá)患者進(jìn)行觀察治療,陽性表達(dá)患者積極采取錐切治療,采取個(gè)體化分流措施以減少生育需求者的創(chuàng)傷。P16染色結(jié)果可作為CINⅡ病變轉(zhuǎn)歸結(jié)局的預(yù)警指標(biāo),可用于CINⅡ患者隨訪的分流管理,優(yōu)化宮頸癌的篩查流程,對于CINⅡ患者干預(yù)或隨訪策略的制定具有指導(dǎo)意義。

        4 參考文獻(xiàn)

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