譚仕旦

摘要：從病死藏獒的病變器官組織中分離培養(yǎng)病原菌，根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)分離、染色、鏡檢、生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)及核酸鑒定等方法確診該病原菌為犬鏈球菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該分離菌對頭孢噻呋鈉、羅紅霉素、替米考星、氧氟沙星、林可霉素、氨芐西林等藥物敏感，對多西環(huán)素中等敏感，對阿米卡星耐藥。分離菌16S rRNA與犬鏈球菌（CG40）同源性達(dá)到99.2%。

關(guān)鍵詞：藏獒；犬鏈球菌；分離；鑒定

中圖分類號：S852.61+1；S858.292 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）17-0079-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.17.020 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： The pathogenic bacteria from the dead bodies of the lesions in organs and tissues of tibetan mastiff was isolated and cultured， according to the diagnosis of bacterial isolation and culture， staining， microscopy， biochemical test， drug sensitive test and the results of 16S rRNA gene sequence analysis， the pathogenic bacteria was proved to be Streptococcus canis. The results of antibiotic susceptibility testing demonstrated that， the Streptococcus canis was highly sensitive to ceftiofur sodium， roxithromycin， tilmicosin， ofloxacin， lincomycin， ampicillin， medium sensitive to doxycycline， resistance to amikacin. Their 16S rRNA was closely related to Strephtococcus canis（CG40） with homologies of 99.2%.

Key words： tibetan mastiff； Streptococcus canis； isolation； identification

鏈球菌（Streptococcus）在自然界中分布廣泛，種類繁多，依據(jù)C物質(zhì)結(jié)構(gòu)和特性抗體的沉淀反應(yīng)，蘭斯菲爾德（Lance-field）分類為20個群和若干血清型[1]。Devriese等[2]從乳房炎奶牛和感染犬中首次分離出犬鏈球菌（Streptococcus canis sp. nov.）。犬鏈球菌屬于G群鏈球菌，DSM 20715菌株， G+C含量為39.5%，革蘭氏陽性菌，常分布于犬、貓等多種動物的皮膚和黏膜上，在外界環(huán)境的不良刺激、機(jī)體抵抗力下降、皮膚和黏膜破損的情況下，感染犬、貓可引起敗血癥、關(guān)節(jié)炎等疾??；感染奶牛可引起奶牛乳房炎；感染人可引起人的敗血癥、腦膜炎等[3]。近年來，犬鏈球菌對犬、貓和人類的危害引起了人們的重視，國際獸疫局已將其確定為一種新的人獸共患病。Pesavento等[4]報道，美國加利福尼亞北部、南部以及北卡羅萊納3個地區(qū)的貓收容所，在兩年內(nèi)先后暴發(fā)了犬鏈球菌感染，共有150多只貓感染發(fā)病，死亡率高達(dá)30%。Galperine等[5]報道犬鏈球菌感染人導(dǎo)致敗血癥死亡。

隨著人們生活水平的提高，寵物行業(yè)快速發(fā)展，伴侶動物日益增多，藏獒已成為很多人喜歡的犬種，但目前國內(nèi)鮮見關(guān)于藏獒犬鏈球菌病的報道。2017年，湖北恩施某藏獒養(yǎng)殖基地發(fā)生疑似犬鏈球菌病，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失?，F(xiàn)將該病的微生物學(xué)診斷結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 病料來源

在實(shí)驗(yàn)室相對無菌的環(huán)境下，對病死藏獒進(jìn)行尸體病理剖檢。剖開腹腔，取出肝臟、脾臟、腎臟、腸系膜淋巴結(jié)，剖開胸腔取出肺臟、心臟，打開顱腔，取其腦髓，觀察記錄各器官的病理變化。然后采集脾臟、腎臟、肝臟、淋巴結(jié)、心臟等病變明顯的部位作為病料。

1.2 主要試劑

10%新生胎牛血清肉湯培養(yǎng)基，自制，所用的胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司。

LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基，自制，配方采用胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、食鹽10 g，搖動容器直至溶質(zhì)溶解。用5 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，用去離子水定容至1 L。高壓蒸汽滅菌21 min。

Thermus aquaticus DNA聚合酶（Taq buffer）、DNA混合物（dNTPs）、膠回收試劑盒、pMD18-T Vector載體、DL 2000 DNA Marker，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

細(xì)菌特殊化試驗(yàn)鑒定管購于杭州天和微生物試劑公司；細(xì)菌藥敏試紙購于廣州市益滿生物科技有限公司。

1.3 細(xì)菌分離與純化培養(yǎng)

在微生物實(shí)驗(yàn)室相對無菌的條件下進(jìn)行病料細(xì)菌的分離與純化培養(yǎng)。操作過程按常規(guī)要求無菌操作，用消毒好的手術(shù)刀切開病變組織器官，將病變組織切口觸壓在10%新生胎牛血清肉湯培養(yǎng)基上，在37 ℃的條件下倒置培養(yǎng)24 h，觀察記錄菌落的生長情況，然后選取長勢好、形態(tài)特征典型一致的優(yōu)勢菌落在相同的條件下作純化培養(yǎng)。

1.4 細(xì)菌染色鏡檢

病料組織中的病原菌經(jīng)分離培養(yǎng)后，選取典型菌落經(jīng)過純化培養(yǎng)，所長出的菌落形態(tài)一致，挑取菌落進(jìn)行涂片，適當(dāng)加熱固定，用革蘭氏染液進(jìn)行染色，油鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)。

1.5 生化鑒定和耐藥性試驗(yàn)

將分離到的單個細(xì)菌在含有10%新生胎牛血清的營養(yǎng)瓊脂板上重新劃線培養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)菌的生化試驗(yàn)和耐藥性試驗(yàn)。

1.6 細(xì)菌16S rRNA鑒定

細(xì)菌核酸的提取，在100 ℃條件下煮沸裂解細(xì)菌，并提取細(xì)菌全部脫氧核糖核酸。操作過程為取純化培養(yǎng)的單個菌落加入到10%新生胎牛血清肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃的條件下，200 r/min搖床培養(yǎng)6～8 h，5 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀用100 μL去離子水重懸，然后煮沸10 min，冷卻至室溫后，10 000 r/min離心1 min，取上清液作DNA模板，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

細(xì)菌16S rRNA通用引物的設(shè)計按照NCBI犬鏈球菌特異片段16S rRNA基因設(shè)計合成一段特異引物[6]，上游引物PA（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′）和下游引物PB（5′-AGGAGGTGATCCAGCC

GCA-3′），對細(xì)菌核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和條件為：10×Taq buffer 5 μL，dNTPs Mixure 4 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，用去離子水補(bǔ)足至50 μL。聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）操作方法為預(yù)變性溫度94 ℃，時間4 min；變性溫度94 ℃，時長 1 min，退火降溫至55 ℃，時長1 min，升溫至72 ℃，延伸1 min，30次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。利用膠回收試劑盒對預(yù)期片段（1 400 bp左右）進(jìn)行回收，用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行驗(yàn)證，將提純的目的片段與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)的大腸桿菌內(nèi)，涂布在LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)過夜，選取陽性克隆增殖培養(yǎng)，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床檢查和病理剖檢結(jié)果

該病臨床發(fā)病較慢，散發(fā)型，初期精神不振，食欲減退，似感冒，中后期體溫升高到40～42 ℃，心跳加快，100次/min以上，脈博節(jié)律不齊，呼吸困難，腹部息癆溝明顯，呈犬坐姿勢，結(jié)膜充血，皮膚充血、淤血、敗血癥反應(yīng)。食欲廢絕，后肢無力，不愿活動，繼而出現(xiàn)麻痹、痙攣等神經(jīng)癥狀，最后抽搐死亡，病程5～10 d。尸體病理剖檢可見肺淤血、出血，呈大葉性肺炎病變；心包腔積聚少量液體，心外膜下冠狀溝處有散在出血點(diǎn)，左右心室肌柔軟，心室腔外積有多量血液；肝臟腫大，呈暗褐色，膽囊脹滿。腎臟輕度腫大，表面有散在出血點(diǎn)、壞死灶，膀胱頸黏膜有少量出血點(diǎn)；脾臟輕度腫大，邊緣增厚有淤血、出血性壞死灶。

2.2 細(xì)菌培養(yǎng)及革蘭染色結(jié)果

細(xì)菌分離純化培養(yǎng)的菌落呈灰白色半透明、細(xì)小如露珠狀、表面光滑且濕潤黏稠，邊緣整齊的圓形或卵圓形，直徑0.1～1.0 mm，并有寬而典型的β溶血環(huán)。取菌落做涂片，革蘭氏染色，在1 600倍油鏡下觀察細(xì)菌呈紫色，為革蘭陽性球菌，菌體較小，有單個存在的，也有成對或鏈狀排列的。

2.3 細(xì)菌的生化試驗(yàn)結(jié)果

該菌的生化試驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.4 藥物敏感試驗(yàn)

藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果見表2。從表2可以看出，該病料分離出的病原菌對頭孢噻呋鈉、羅紅霉素、替米考星、氧氟沙星、林可霉素、氨芐西林等抗菌藥物敏感，對多西環(huán)素中等敏感，對阿米卡星耐藥。

2.5 細(xì)菌16S rRNA鑒定

在1%的瓊脂糖凝膠上可以明顯看到，在預(yù)期片段1 400 bp左右有較亮的目的條帶（圖1）。對該片段進(jìn)行回收和測序，序列經(jīng)Blast程序搜索與基因庫CG40序列比對，該分離菌與犬鏈球菌的同源性達(dá)到99.2%。

通過以上臨床檢查、細(xì)菌分離培養(yǎng)與鏡檢、細(xì)菌生化試驗(yàn)、細(xì)菌藥敏試驗(yàn)、細(xì)菌PCR鑒別的結(jié)果，確定該病原體為犬鏈球菌。

3 小結(jié)

本次藏獒發(fā)病后，經(jīng)臨床檢查、尸體病理解剖，疑似犬鏈球菌病，然后將尸體病變組織中的細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)、細(xì)菌染色鏡檢、細(xì)菌生化鑒別試驗(yàn)、細(xì)菌藥物敏感試驗(yàn)和細(xì)菌PCR鑒定，試驗(yàn)研究結(jié)果確定病原體為犬鏈球菌，準(zhǔn)確診斷該病為藏獒犬鏈球菌病。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，犬鏈球菌對頭孢噻呋鈉、羅紅霉素、替米考星、氧氟沙星、林可霉素、氨芐西林等抗菌藥物敏感。近年來，國內(nèi)外相關(guān)資料報道了犬鏈球菌感染犬、貓、奶牛和人，但犬鏈球菌感染藏獒發(fā)病的報道很少見，本次藏獒犬鏈球菌病的研究結(jié)果，為更好地預(yù)防和治療該病提供了科學(xué)的參考依據(jù)。試驗(yàn)結(jié)果與齊凱歌等[7]關(guān)于狐源犬鏈球菌的分離鑒定結(jié)果基本一致，下一步還將對該犬鏈球菌的致病性和流行病學(xué)作進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 孔憲剛. 獸醫(yī)微生物學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013.

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[3] 趙 婷，馬 良，田克恭.犬鏈球菌感染研究進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)雜志，2010，46（9）：56-58.

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[6] DUGA S，GOBBI A，ASSELTA R，et al. Analysis of the 16S rRNA gene sequence of the coryneform bacterium associated with hyperkeratotic dermatitis of athymic nude mice and development of a PCR-based detection assay[J].Mol Cell Probes，1998， 12（4）：191-199.

[7] 齊凱歌，薛 原，孫 萌，等.狐源犬鏈球菌的分離鑒定[J].畜牧與獸醫(yī)，2017，49（8）：93-97.