趙留濤 ，吳洪銀，吳冠連，陳五常，徐洪德，袁之潤(rùn)，吳春麗,4*

(1.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州 450001；2.商丘愛己愛牧生物科技股份有限公司，河南虞城 476300；3.鄭州愛己愛牧生物技術(shù)有限公司，河南鄭州 450001；4.鄭州市新型獸藥制劑創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450001)

北芪五加顆粒由黃芪和刺五加，經(jīng)水煎煮提取，減壓濃縮成浸膏，加輔料混合均勻，制成顆粒，具有益氣健脾功能[1-2]。本研究在前期急性毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，參照《中藥、天然藥物長(zhǎng)期毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》相關(guān)規(guī)定[3]，對(duì)其長(zhǎng)期用藥的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 北芪五加顆粒，批號(hào)20110203(北芪五加顆粒浸膏和北芪五加顆粒原料)，規(guī)格1 g∶1 g生藥，由商丘愛己愛牧生物科技股份有限公司提供。臨用前用無(wú)菌水配成0.250、0.125、0.062 5 g/mL的液體。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 5周齡SD大鼠120只，SPF級(jí)，雌雄各半，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK(豫)2010-0002。

1.1.3 主要儀器與試劑 ABX-PENTRA-80全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀檢測(cè)，法國(guó)Horiba ABX公司產(chǎn)品；BT-2000PLUS生化分析儀，意大利產(chǎn)Biotemcnica公司產(chǎn)品；XSP-24N型生物顯微鏡，南京江南光電集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)；FA1004N電子天平，上海精密科學(xué)儀器公司天平儀器廠生產(chǎn)；YD-12P型全自動(dòng)生物組織脫水機(jī)、 YD-6L型全自動(dòng)生物組織冷凍包埋機(jī)、 YD-6D型全自動(dòng)生物組織包埋機(jī)、 YD-B型智能型生物組織烤片機(jī)、 YD-A型智能型生物組織攤片機(jī)，浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；LEICA RM2235型生物組織切片機(jī)，德國(guó)LEICA公司生產(chǎn)；XSP-24N型光學(xué)顯微鏡，南京江南光電集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)；DM-BA300數(shù)碼生物顯微鏡，廈門麥克奧迪公司生產(chǎn)。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)試盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測(cè)試盒、尿素氮(BUN)測(cè)試盒、血清(漿)尿肌酐(Cr)測(cè)試盒、總蛋白(TP)測(cè)試盒、白蛋白(ALB)測(cè)試盒、葡萄糖(GLU)測(cè)試盒和甘油三酯(TG)測(cè)試盒等，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 選用臨床健康大鼠80 只，隨機(jī)分為4 個(gè)組，每組20只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，用雙染色法進(jìn)行編號(hào)標(biāo)記。由實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)北芪五加顆粒原料急性毒性試驗(yàn)研究結(jié)果可知，以最大給藥量(即67.5 g/kg 體重)給藥后，小鼠未見任何異常與死亡。依據(jù)獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編(2006年-2011年)中《獸藥30 d和90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)指導(dǎo)原則》[4]及不同種類動(dòng)物間用藥劑量換算公式[5-6]。豬，每kg飼料4.0 g，連用7 d，即等同于豬每天每kg體重顆粒用量0.32 g～0.4 g(相當(dāng)于豬每天每kg體重用干浸膏0.04～0.05 g)。設(shè)計(jì)給藥劑量，即北芪五加顆粒原料5、2.5、1.25 g/kg和空白對(duì)照組，給藥各組分別以豬每日臨床100、50、25倍劑量的北芪五加顆粒原料給大鼠灌胃，按20 mL/kg體重的用量，每天上午灌胃給藥1次，空白對(duì)照組灌服同體積的無(wú)菌水。

1.2.2 觀察指標(biāo)[7-10]

1.2.2.1 一般觀察 試驗(yàn)期間逐日觀察并記錄大鼠的精神狀態(tài)、行為表現(xiàn)、采食情況、糞便。

1.2.2.2 體重影響 每周逐只稱重1次，并根據(jù)體重變化調(diào)整灌胃量，連續(xù)給藥28 d，觀察至給藥結(jié)束。

1.2.2.3 血液學(xué)及血液生化指標(biāo)測(cè)定 給藥第28天停藥，各組末次給藥 24 h后，稱重、采血，用于生理和生化指標(biāo)測(cè)定，血液學(xué)檢查指標(biāo)包括白細(xì)胞數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、血紅蛋白含量(HGB)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)及其分類[中性粒細(xì)胞(NEU)、淋巴細(xì)胞(LYM)、單核細(xì)胞(MON)、嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)、嗜堿性粒細(xì)胞(BAS)]；血液生化檢查指標(biāo)包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、血清白蛋白(ALB)、血葡萄糖(GLU)和甘油三酯(TG)。

1.2.2.4 剖檢情況 給藥第28天，將采血后的20只大鼠處死，進(jìn)行系統(tǒng)剖檢，肉眼觀察其組織器官，同時(shí)取其心、肝、腎、肺、脾睪丸、卵巢、子宮等臟器進(jìn)行稱重，計(jì)算臟器系數(shù)。臟器系數(shù)(%)= 臟器(mg)/體重(g)×100%

1.2.3 數(shù)據(jù)分析處理 采用SPSS11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,One-way ANOVA法檢驗(yàn)，組間用LSD法兩兩比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 一般觀察

整個(gè)試驗(yàn)過程中，4組大鼠精神狀態(tài)、行為表現(xiàn)、采食情況均正常，糞便呈棕黑色顆粒狀。

2.2 體重變化情況

大鼠連續(xù)灌胃給藥28 d后,各給藥組雌雄動(dòng)物的體重及增值與對(duì)照組動(dòng)物比較，除雌性小鼠2.5 g/kg給藥組給藥第21天體重與對(duì)照組相比體重增加且差異顯著(P<0.05)外，其余各組均未見顯著性差異(表1)。

2.3 血常規(guī)指標(biāo)變化

大鼠灌胃給藥28 d后對(duì)所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行血液學(xué)檢測(cè)。其中，雌性動(dòng)物2.5 g/kg給藥組RBC數(shù)較對(duì)照組極顯著升高(P<0.01)，雄性動(dòng)物2.5 g/kg、5 g/kg給藥組WBC較對(duì)照組極顯著降低(P<0.01)，雄性動(dòng)物2.5 g/kg給藥組MONO較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，其他指標(biāo)均未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。

2.4 血液生化指標(biāo)變化

大鼠灌胃給藥28 d后對(duì)所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行血液生化學(xué)檢測(cè)。其中，雄性動(dòng)物2.5 g/kg給藥組、5 g/kg給藥組TG較對(duì)照組極顯著降低(P<0.01)。其他指標(biāo)均未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表3)。

表1 北芪五加顆粒對(duì)大鼠體重的影響

注：與空白對(duì)照組相比，“*”P<0.05 差異顯著。

Note：Compared with blank control group,“*”significant difference(P<0.05).

表2 北芪五加顆粒對(duì)大鼠血常規(guī)的影響

注：與空白對(duì)照組相比，“*”P<0.05 差異顯著，“* *”P<0.01 差異極顯著。

Note：Compared with blank control group,“*”significant difference(P<0.05); “* *”very significant difference(P<0.01).

2.5 主要臟器系數(shù)測(cè)定結(jié)果

大鼠連續(xù)給藥28 d后雄性動(dòng)物2.5 g/kg、5 g/kg給藥組肝臟的臟器系數(shù)較對(duì)照組極顯著減小(P<0.01)，并呈濃度依賴性；而在雌性動(dòng)物，只有5 g/kg給藥組肝臟的臟器系數(shù)較對(duì)照組極顯著減小(P<0.01)。其余各組均未見顯著性差異(表4)。

2.6 組織病理學(xué)檢查

HE染色后鏡檢觀察，高劑量組大鼠的心、肝、脾、肺、腎與空白對(duì)照組相比，均未見與受試物毒性作用相關(guān)的組織病理學(xué)變化。

3 討論

表3 北芪五加顆粒對(duì)大鼠血生化指標(biāo)影響

注：與空白對(duì)照組相比，“* *”P<0.01 差異極顯著。

Note：Compared with blank control group,“* *”very significant difference(P<0.01).

表4 北芪五加顆粒對(duì)大鼠主要臟器系數(shù)測(cè)定結(jié)果

注：與空白對(duì)照組相比，“* *”P<0.01 差異極顯著。

Note：Compared with blank control group,“* *”very significant difference(P<0.01).

北芪五加顆粒原料以1.25、2.5、5 g/kg等3個(gè)劑量，連續(xù)給藥28 d，試驗(yàn)觀察期間，各組動(dòng)物的精神狀態(tài)、行為表現(xiàn)、采食、飲水、糞便均正常。其中，雌性大鼠2.5 g/kg給藥組第21天體重與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其余各組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在血液學(xué)及血液生化學(xué)分析中顯示雌性動(dòng)物2.5 g/kg給藥組RBC數(shù)較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，雄性動(dòng)物2.5 g/kg、5 g/kg給藥組WBC較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，雄性動(dòng)物1.25 g/kg給藥組MONO較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，雄性動(dòng)物2.5 g/kg、5 g/kg給藥組TG較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這些指標(biāo)改變均無(wú)劑量依賴趨勢(shì)，也未超出本試驗(yàn)參考范圍[11-13]，提示該項(xiàng)改變與供試品毒性無(wú)關(guān)。在臟器指數(shù)檢測(cè)中，肝的臟器系數(shù)高劑量組較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[14]，但改變無(wú)劑量依賴關(guān)系，且病理學(xué)組織檢查未見與藥物毒性相關(guān)的病理改變，表明上述改變非藥物毒性所致。卞愧等在五加芪粉長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)研究結(jié)果表明,五加芪粉以8.4 g/kg連續(xù)灌胃給藥28 d未對(duì)大鼠產(chǎn)生毒副作用[15]，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，SD大鼠灌胃給予北芪五加顆粒原料以1.25、2.5、5 g/kg等3個(gè)劑量，分別是臨床擬用量的25、50、100倍，連續(xù)給藥28 d并未對(duì)大鼠產(chǎn)生毒副作用。因此，北芪五加顆粒按照推薦的給藥劑量和療程使用，無(wú)長(zhǎng)期毒性，臨床應(yīng)用安全。