李華軍, 陳 茜

(浙江司太立制藥股份有限公司, 浙江 臺(tái)州 317300)

碘帕醇是一種非離子型水溶性碘造影劑,具有良好的顯影作用,對(duì)血管壁及神經(jīng)組織毒性小,不良反應(yīng)少,性質(zhì)穩(wěn)定,適用范圍廣,主要用于神經(jīng)放射學(xué)、血管造影術(shù)、泌尿系統(tǒng)造影術(shù)、CT檢查中增強(qiáng)掃描、關(guān)節(jié)造影術(shù)、數(shù)字減影血管造影術(shù)[1-3]。美國藥典(USP)40版[4]、歐洲藥典(EP)9.0版[5]和日本藥典(JP)17版[6]均收錄了此品種。

碘帕醇分離純化困難,原因在于粗品中含有較多結(jié)構(gòu)相似的雜質(zhì)(A～K結(jié)構(gòu)見圖1[5])。美國藥典[4]和歐洲藥典[5]都對(duì)其含量做了嚴(yán)格的限定。EP 9.0版[5]規(guī)定,有關(guān)雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G、J和K的單一雜質(zhì)峰面積不得高于總峰面積的0.1% ,有關(guān)雜質(zhì)H和I的峰面積之和須小于總峰面積的0.5% 。關(guān)于碘帕醇的分離純化研究報(bào)道相對(duì)較少[7,8]。目前,碘帕醇生產(chǎn)中使用大孔吸附樹脂吸附法,該方法生產(chǎn)周期長,分離柱效低,自動(dòng)化程度不高,工藝穩(wěn)定性不好,不利于產(chǎn)品質(zhì)量的控制[9]。同時(shí),樹脂再生還會(huì)產(chǎn)生大量的廢水,不利于環(huán)保。因此,發(fā)展一種快速、穩(wěn)定、高效、環(huán)保的分離純化技術(shù)是相關(guān)生產(chǎn)廠家的迫切需求。

高效液相色譜法采用粒度均勻的小顆粒填料,具有高于大孔樹脂的柱效,同時(shí)可采用自動(dòng)化的儀器設(shè)備實(shí)現(xiàn)精確流速和在線監(jiān)測(cè)。在碘帕醇的工業(yè)生產(chǎn)上使用這種更加先進(jìn)的分離技術(shù),可有效提高其生產(chǎn)水平。本文基于HPLC技術(shù),分別考察了固定相種類、柱溫和上樣量對(duì)樣品分離的影響,并將優(yōu)化后的條件放大到制備水平上,對(duì)碘帕醇料液進(jìn)行分離純化。同時(shí)考察了各個(gè)雜質(zhì)的分布和收集策略,在保證高回收率的條件下,獲得高純度的碘帕醇樣品。

圖 1 碘帕醇及其相關(guān)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)[5]Fig. 1 Structures of iopamidol and its related substances[5]

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

碘帕醇料液及餾分分析采用Agilent 1260 Infinity Ⅱ液相色譜系統(tǒng)(美國Agilent公司);碘帕醇料液純化采用動(dòng)態(tài)軸向加壓純化系統(tǒng)DAC-HB50(江蘇漢邦科技有限公司)。

色譜條件優(yōu)化中采用的兩款不同鍵合量C18填料均購于浙江華譜新創(chuàng)科技有限公司,粒徑10 μm,孔徑10 nm,鍵合量(含碳量)分別為13.7%(C18-1)和11.5%(C18-2),裝填250 mm×4.6 mm的色譜柱。

碘帕醇及制備餾分分析所用乙腈和超純水均為美國Sigma-Aldrich色譜純?nèi)軇７治鲋鶠閆orbax SB-phenyl (250 mm×4.6 mm, 5 μm),購于美國Agilent公司。

碘帕醇料液純化所用甲醇為工業(yè)甲醇,水為純化水(車間自制)。

碘帕醇料液由浙江司太立制藥股份有限公司車間合成,碘帕醇色譜純度為86.16% 。

1.2 色譜條件

碘帕醇料液的純化:制備料液為碘帕醇車間生產(chǎn)料液,經(jīng)外標(biāo)定量后測(cè)定的碘帕醇質(zhì)量濃度為230 g/L。制備水平采用與分析條件優(yōu)化時(shí)相同的固定相C18-1(10 μm);稱取330 g,裝填制備柱(制備柱型號(hào)為DAC-HB50,內(nèi)徑為50 mm),裝填高度約270 mm。流動(dòng)相A為水,B為甲醇。線性梯度洗脫:0～60.0 min, 100%A; 60.0～60.5 min, 100%A～20%A; 60.5～80.0 min, 20%A。流速:60 mL/min;柱溫:20 ℃;檢測(cè)波長:240 nm;碘帕醇料液的進(jìn)樣體積:6.5 mL;收集方式:36～60 min收集8個(gè)餾分(見表2)。

碘帕醇料液及制備餾分中雜質(zhì)的分析:采用EP 9.0版[5]規(guī)定的碘帕醇有關(guān)物質(zhì)的液相色譜測(cè)定方法,對(duì)料液和純化后的各個(gè)餾分進(jìn)行分析,具體方法如下。Zorbax SB-phenyl色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流動(dòng)相A為水,B為乙腈-水(50∶50, v/v)。線性梯度洗脫:0～18 min, 100%A; 18～40 min, 100%A～62%A; 40～45 min, 62%A～50%A; 45～50 min, 50%A～100%A; 50～60 min, 100%A。流速:2.0 mL/min;柱溫:60 ℃;檢測(cè)波長:240 nm;進(jìn)樣體積:20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品雜質(zhì)分析

碘帕醇料液中碘帕醇有關(guān)物質(zhì)的色譜圖見圖2,碘帕醇的色譜純度為86.16% 。按照文獻(xiàn)[5]規(guī)定的相對(duì)保留時(shí)間(RRT)比對(duì)各個(gè)雜質(zhì)(見表1)。雜質(zhì)I和H、K、C、J、A、E、F的色譜峰面積百分比分別為0.28% 、0.11% 、0.13% 、0.10% 、0.35% 、0.40% 、0.37% 。另外,色譜峰面積百分比超過0.1%的雜質(zhì)還有7個(gè),RRT分別為:0.21、0.25、0.52、2.25、2.45、2.74,對(duì)應(yīng)的色譜峰面積百分比分別為:7.86% 、1.60% 、0.68% 、0.10% 、0.11% 、0.12% 、0.14% ?？梢?碘帕醇料液未達(dá)到雜質(zhì)限量要求[5],需對(duì)料液做進(jìn)一步的純化,降低雜質(zhì)含量。

圖 2 碘帕醇料液中有關(guān)物質(zhì)的色譜圖Fig. 2 Chromatogram of iopamidol related substances in crude iopamidol solution Column: Zorbax SB-phenyl (250 mm×4.6 mm, 5 μm); mobile phase: water (A), water-acetonitrile (50∶50, v/v)(B). Gradient: 0-18 min, 100%A; 18-40 min, 100%A-62%A; 40-45 min, 62%A-50%A; 45-50 min, 50%A-100%A; 50-60 min, 100%A-100%A. Flow rate: 2.0 mL/min; column temperature: 60 ℃; injection volume: 20 μL; detection wavelength: 240 nm. Peak names are the same as those in Fig. 1.

Compound names are the same as those in Fig. 1. The retention time of iopamidol in Ref. [5] is about 14.6 min.

2.2 用于純化制備的液相色譜條件的優(yōu)化

碘帕醇是一種極性較強(qiáng)的化合物,在傳統(tǒng)C18固定相上保留較弱,不易與雜質(zhì)分離。本實(shí)驗(yàn)選擇了兩款不同鍵合量的C18固定相(C18-1和C18-2),均具有良好的水浸潤性,能在純水條件下使用[10,11]。故實(shí)驗(yàn)以水作為流動(dòng)相,比較了碘帕醇在這兩種固定相上的分離情況。如圖3所示,碘帕醇在C18-1上的保留(容量因子(k)=13.11)強(qiáng)于C18-2(k=8.73)。因此,實(shí)驗(yàn)選擇C18-1作為碘帕醇料液分離純化的固定相,純水作為初始流動(dòng)相。此外,使用純水作為碘帕醇的洗脫溶劑有利于碘帕醇樣品的溶解,滿足后續(xù)的放大生產(chǎn)要求,也體現(xiàn)了經(jīng)濟(jì)環(huán)保的特點(diǎn)。

圖 3 碘帕醇料液在C18-1和C18-2固定相上的色譜圖Fig. 3 Analytical chromatograms of the crude iopamidol solution on stationary phases C18-1 and C18-2 Mobile phase: water (A), methanol (B). Gradient: 0-60.0 min, 100%A; 60.0-60.5 min, 100%A-20%A; 60.5-80.0 min, 20%A. Flow rate: 0.5 mL/min; column temperature: 20 ℃; injection volume: 2 μL; wavelength: 240 nm.

柱溫是HPLC的一個(gè)重要條件,它對(duì)k值存在明顯的影響[12-14]。根據(jù)Van’t Hoff方程,大多數(shù)溶質(zhì)分子的保留會(huì)隨著溫度的變化而變化,且可用公式(1)表達(dá):

logk=A+B/T

(1)

對(duì)于特定的溶質(zhì)分子,A和B是獨(dú)立于溫度的常數(shù),T代表溫度(K)。實(shí)驗(yàn)考察了柱溫為15、20、25和30 ℃時(shí)碘帕醇保留的變化。如圖4所示,隨著柱溫的升高,碘帕醇的保留逐漸減弱,分離效果變差。將保留因子與柱溫按式(1)進(jìn)行擬合,可得:logk=0.002 1+0.001 1/T,線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2,結(jié)果表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。較低的柱溫有利于樣品的分離,然而對(duì)于生產(chǎn)來說溫度過低,生產(chǎn)周期增長,生產(chǎn)效率降低,同時(shí)能耗也會(huì)增加。因此,選擇溫度為20～25 ℃對(duì)于生產(chǎn)控制是較為合適的。

圖 4 柱溫對(duì)料液中碘帕醇保留的影響Fig. 4 Effect of column temperature on the retention of iopamidol Column: C18-1 (250 mm×4.6 mm, 10 μm); column temperature: (a) 30 ℃, (b) 25 ℃, (c) 20 ℃, (d) 15 ℃; injection volume: 50 μL. Other conditions are the same as Fig. 3.

上樣量在制備色譜中也是一個(gè)關(guān)鍵因素。隨著上樣量增加,色譜峰變寬,從而可能影響主峰與雜質(zhì)的分離度,降低制備樣品的純度[15,16]。本實(shí)驗(yàn)在0.23～23 mg范圍內(nèi)考察了上樣量對(duì)峰形變化的影響(見圖5)。當(dāng)上樣量為0.23 mg時(shí),主峰峰形呈現(xiàn)良好的對(duì)稱性(對(duì)稱因子為1.10)。隨著上樣量增加,色譜峰向前展寬。當(dāng)上樣量增加到一定程度時(shí),前雜會(huì)與主峰發(fā)生交叉,影響主峰純度。因此在放大制備過程中要選擇合適的上樣量,以便獲取高純度的樣品。

圖 5 上樣量對(duì)碘帕醇峰形的影響Fig. 5 Effect of loading amount on peak shape of iopamidol Column: C18-1 (250 mm×4.6 mm, 10 μm). Other conditions are the same as Fig. 3.

2.3 樣品的制備

在4.6 mm內(nèi)徑的分析柱上進(jìn)行條件優(yōu)化后,在DAC50純化系統(tǒng)上開展了放大制備實(shí)驗(yàn),制備條件見1.2節(jié),制備譜圖如圖6所示。

圖 6 碘帕醇的制備色譜圖Fig. 6 Preparative chromatogram of iopamidol Column: C18-1 (270 mm×50 mm, 10 μm); flow rate: 60 mL/min; injection volume: 6.5 mL. Other conditions are the same as Fig. 3.

碘帕醇料液在制備水平同樣得到了較好的分離。為了進(jìn)一步考察碘帕醇主峰(保留時(shí)間為36～60 min)與有關(guān)雜質(zhì)的分離情況,對(duì)該時(shí)間段的樣品進(jìn)行了分段收集,共獲得8個(gè)餾分,直接進(jìn)液相色譜檢測(cè)。HPLC結(jié)果顯示,雜質(zhì)K、雜質(zhì)C和雜質(zhì)A均未檢出,雜質(zhì)I和H、雜質(zhì)J、雜質(zhì)E和雜質(zhì)F在各個(gè)餾分中的色譜峰面積百分比與原料相比都有顯著的降低(見表2)。

54～58 min和58～60 min兩個(gè)餾分中,雜質(zhì)J的色譜峰面積百分比都超過了0.1% 。因此,本文將保留時(shí)間36～54 min的餾分合并,進(jìn)行HPLC檢測(cè), 有關(guān)雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G、J、K均未檢出,雜質(zhì)I和H的峰面積百分比為0.22%(見圖7),相關(guān)物質(zhì)含量符合限量規(guī)定(雜質(zhì)I和H<0.5% ,雜質(zhì)J、E、F<0.1% )。對(duì)該餾分進(jìn)行回收率計(jì)算,結(jié)果表明碘帕醇的色譜純度為98.97% ,碘帕醇的回收率可達(dá)93.44% 。經(jīng)過制備HPLC純化,可以在保證高回收率的條件下有效降低雜質(zhì)水平。

圖 7 合并餾分(36～54 min)的分析色譜圖Fig. 7 Analytical chromatogram of combined fractions (36-54 min) Injection volume: 40 μL; other conditions are the same as Fig. 2.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于制備液相色譜法,考察不同色譜固定相、柱溫及上樣量對(duì)碘帕醇的保留與分離的影響,優(yōu)化碘帕醇分離純化參數(shù),并放大到制備水平,考察碘帕醇的純度及雜質(zhì)分布情況,得到了高純度的碘帕醇樣品。所得樣品質(zhì)量穩(wěn)定可控、關(guān)鍵雜質(zhì)指標(biāo)均在合格范圍內(nèi)。與現(xiàn)有的大孔吸附樹脂純化工藝相比,該方法具有高效、穩(wěn)定、快速等特點(diǎn),而且對(duì)碘帕醇雜質(zhì)的去除效果好,回收率高,可以為碘帕醇分離純化生產(chǎn)工藝的開發(fā)提供新的思路。