錢紅,王輝,牛國梁,趙娟霞,曹桂明
(南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院 1.病理科,2.胃腸外科,3.腫瘤科,湖南 衡陽 421002)
結(jié)直腸腺癌(colorectal adenocarcinoma, CRC)是人類常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和病死率在我國已呈逐年上升趨勢,其發(fā)生、發(fā)展可能是在遺傳、環(huán)境等多種因素作用下發(fā)生的一個多步驟、多階段的復(fù)雜過程,具體機制尚不清楚。研究證明,表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)和尾型同源框轉(zhuǎn)錄因子2(caudal type homeobox genes 2,CDX2)在腫瘤細胞的增殖、分化、遷移以及預(yù)后方面發(fā)揮重要作用,但在結(jié)直腸腺癌中EGFR和CDX2對患者臨床病理表現(xiàn)的影響和意義以及它們相互之間的關(guān)系研究結(jié)論不一。本實驗采用免疫組織化學(xué)方法檢測結(jié)直腸腺癌及正常腸黏膜中EGFR和CDX2的表達,并結(jié)合臨床、病理資料進行分析探討。
選取2014年1月-2016年10月南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院病理科結(jié)直腸腺癌手術(shù)標本170例。所有患者術(shù)前均未進行放射或化學(xué)治療。選取30例無癌患者正常腸黏膜作對照,男女比為19∶11,中位年齡51歲,平均年齡59歲。
所有腫瘤標本均經(jīng)10%中性甲醛固定12~48 h,常規(guī)脫水、石蠟包埋切片,HE和免疫組織化學(xué)染色,由兩名病理診斷醫(yī)生雙盲作出病理診斷、組織學(xué)分類及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷,意見不一致的再共同討論決定。病理診斷及組織學(xué)分類按照WHO(2010版)標準。免疫組織化學(xué)用SP法染色,試劑盒及抗體購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;EGFR(RMA-0689)、CDX2(EPR2764Y)均為即用型兔抗人單克隆抗體。操作步驟嚴格按照說明書進行,以已知陽性切片做陽性對照,以PBS代替一抗為陰性對照。
顯微鏡下觀察,EGFR陽性染色定位于細胞膜和/或細胞質(zhì),CDX2陽性染色定位于細胞核;染色為淡黃色、棕黃色或深棕色為陽性;按照以下標準進行計分:①陽性染色判定標準:未染色0分,淡黃色1分,棕黃色2分,深棕色3分;②陽性細胞數(shù)判定標準:按每400高倍視野陽性細胞占腫瘤細胞的百分比:>1%0分,1%~24% 1分,25%~50% 2分;>50% 3分;③以上兩項評分乘積為最后得分:<中位分值為低表達,≥中位分值為高表達。
數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件,計數(shù)資料用例表示,采用χ2檢驗和χ2分割法(檢驗水準經(jīng)矯正后α=0.008);EGFR和CDX2的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析及χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
170例結(jié)直腸腺癌患者年齡28~85歲,中位年齡62歲,平均60歲;<60歲的73例(42.9%),≥60歲的97例(57.1%);男性112例(65.9%),女性58例(34.1%),男女比1.9∶1;腫塊最大徑0.8~15 cm,中位4 cm,平均4.3 cm,其中最大徑<4 cm的96例(56.5%),≥4 cm的74例(43.5%);浸潤至黏膜肌層9例(5.3%),浸潤肌層33例(19.4%),侵及全層或外膜脂肪組織128(75.3%)例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移55例(32.4%),神經(jīng)侵犯30例(17.6%),脈管內(nèi)癌栓或血管壁侵犯29例(17.1%),系膜或網(wǎng)膜出現(xiàn)癌結(jié)節(jié)26例(15.3%);高、中、低分化腺癌分別為44、100、26例,分別占總例數(shù)的25.9%、58.8%、15.3%。
結(jié)直腸腺癌中EGFR細胞膜和/或細胞質(zhì)呈不同程度的淡黃色至深褐色著色(見圖1)。170例結(jié)直腸腺癌EGFR免疫組織化學(xué)染色最后綜合得分中位數(shù)為4分,因此選定<4分者為低表達,≥4分者為高表達;EGFR高、低表達分別為61例(35.88%)及109例(64.12%),其中高、中、低分化腺癌的EGFR高表達率分別為31.82%、35.00%、46.15%,并且隨著腺癌分化程度的降低而逐漸增加。正常腸黏膜中EGFR主要為細胞膜著色;30例對照組中EGFR高表達3例,高表達率為10.00%。不同分化程度結(jié)直腸腺癌的EGFR高表達率與正常腸黏膜上皮EGFR高表達率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.481,P=0.024),然后進行χ2分割法比較,結(jié)果顯示,中分化與低分化結(jié)直腸腺癌的EGFR高表達率與正常腸黏膜上皮EGFR高表達率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.008),而高分化結(jié)直腸腺癌的EGFR高表達率與正常腸黏膜上皮EGFR高表達率比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.008)。但不同分化程度的結(jié)直腸腺癌EGFR高表達率兩兩比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表 1。
圖1 結(jié)直腸腺癌EGFR表達 (SP×400)
表1 不同分化程度的結(jié)直腸腺癌及正常腸黏膜EGFR表達
圖2 結(jié)直腸腺癌CDX2表達 (SP×200)
CDX2在結(jié)直腸腺癌及正常腸黏膜上皮中均為細胞核著色,呈不同程度的淺棕黃色至棕褐色顆粒樣,近核周的胞質(zhì)中也有少量顆粒樣著色(見圖2)。CDX2高、低表達分別為143例(84.12%)及27例(15.88%),其中高、中、低分化腺癌的CDX2高表達率分別為90.92%、87.00%和61.54%。30例正常腸黏膜中CDX2均呈高表達,表達率為100%。不同分化程度的結(jié)直腸腺癌組織與正常腸黏膜CDX2高表達率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=12.063,P=0.002),然后進行χ2分割法比較,結(jié)果顯示,低分化結(jié)直腸腺癌的EGFR高表達率與正常腸黏膜上皮CDX2高表達率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.008),而高分化與中分化結(jié)直腸腺癌的CDX2高表達率與正常腸黏膜上皮CDX2高表達率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.008)。但不同分化程度的結(jié)直腸腺癌CDX2高表達率兩兩比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。
表2 不同分化程度的結(jié)直腸腺癌組織及正常腸黏膜CDX2表達情況
170例結(jié)直腸腺癌中,EGFR表達與年齡、性別、分化程度、腫塊直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、系膜或網(wǎng)膜癌結(jié)節(jié)形成、浸潤深度、神經(jīng)侵犯、脈管癌栓形成均無關(guān),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);但CDX2表達與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管內(nèi)癌栓形成有關(guān)(P<0.05),其中,低分化結(jié)直腸腺癌的CDX2高表達率(61.54%)低于高分化及中分化結(jié)直腸腺癌的高表達率(90.92%及87.00%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者CDX2高表達率(86.96%)高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(78.18%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);無脈管內(nèi)癌栓形成者CDX2高表達率(86.52%)高于脈管內(nèi)癌栓形成病例(72.41%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);但CDX2蛋白表達與年齡、性別、腫塊直徑、系膜或網(wǎng)膜癌結(jié)節(jié)的形成、浸潤深度、神經(jīng)侵犯等無關(guān)(P>0.05)。見表 3。
EGFR高表達的61例中,CDX2高表達8例,低表達53例,高表達率為13.11%;EGFR低表達的109例中,CDX2高表達90例,低表達19例,高表達率為82.57%。EGFR和CDX2蛋白表達的Spearman相關(guān)分析(r=0.057,P=0.463)及χ2檢測(χ2=0.545,P=0.518)結(jié)果均提示兩者無相關(guān)性,見表4。
表3 結(jié)直腸腺癌EGFR和 CDX2蛋白表達與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系
表4 結(jié)直腸腺癌CDX2與EGFR表達的相互關(guān)系 例(%)
EGFR是一種具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜受體,通過介導(dǎo)多種途徑的信號通路調(diào)控細胞生長、遷移、黏附、增殖、分化、凋亡和存活,并與腫瘤的形成、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成、細胞凋亡的抑制和惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。結(jié)直腸腺癌中EGFR表達上調(diào),與預(yù)后差、轉(zhuǎn)移快、復(fù)發(fā)早、生存期短及化療耐藥等相關(guān)[1-3]。免疫組織化學(xué)檢測是目前臨床評價EGFR表達的常用方法之一[4],但報道的EGFR表達率差異較大。為了更準確地反應(yīng)結(jié)直腸腺癌中EGFR蛋白陽性表達的范圍和程度,本組采用復(fù)合性評分系統(tǒng)[5],以陽性結(jié)果評分與陽性細胞數(shù)評分的乘積作為最后得分。本研究顯示,隨著分化程度的降低,EGFR高表達率逐漸增加,尤其是中分化與低分化結(jié)直腸腺癌的EGFR高表達率與正常腸黏膜上皮EGFR高表達率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,表明EGFR高表達與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生及分化程度關(guān)系密切,與文獻報道一致[3,6-7]。但EGFR表達與年齡、性別、分化程度、腫塊直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、系膜或網(wǎng)膜結(jié)節(jié)的形成、浸潤深度、神經(jīng)侵犯、脈管內(nèi)癌栓形成均無關(guān),而且高分化結(jié)直腸腺癌的EGFR高表達率與正常腸黏膜上皮EGFR高表達率比較差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義,提示EGFR蛋白表達不適合單獨作為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸腺癌的預(yù)后指標,與部分研究報道不一致[7-8],這可能與EGFR表達的判定標準不同,或與本組結(jié)直腸腺癌大多屬臨床中晚期有關(guān)。此外,有學(xué)者提出引起結(jié)直腸腺癌細胞增殖和遷移的EGFR的轉(zhuǎn)錄機制存在多種信號通路[9-10],這也提示不能通過單一分子的表達來評判腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。
CDX2是一種特異性的腸道核轉(zhuǎn)錄因子,亦是腸道腫瘤發(fā)生機制中發(fā)揮作用的一個關(guān)鍵因子[11]。有文獻報道[12-16],CDX2是一種抑癌基因,特異性表達于腸上皮性腫瘤中,在引導(dǎo)和維持腸上皮形態(tài)和功能方面具有重要作用,能夠調(diào)節(jié)大量腸道特異性基因的表達,與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。本研究結(jié)果顯示,CDX2對診斷結(jié)直腸腺癌具有敏感性,是結(jié)直腸腺癌診斷和鑒別診斷的良好指標。本組高、中、低分化結(jié)直腸腺癌中,CDX2高表達率均低于正常腸黏膜CDX2表達,表明結(jié)直腸腺癌中的CDX2蛋白表達受到抑制;尤其是低分化結(jié)直腸腺癌的CDX2高表達率低于高、中分化結(jié)直腸腺癌,而且低分化結(jié)直腸腺癌的CDX2高表達率與正常腸黏膜上皮CDX2高表達率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,說明CDX2的表達隨結(jié)直腸腺癌細胞分化程度降低而下調(diào),分化越差,下調(diào)越明顯,這種現(xiàn)象也提示CDX2具有引導(dǎo)和維持腸上皮形態(tài)和功能的作用,支持CDX2是一種抑癌基因的觀點。
本研究還發(fā)現(xiàn),29例脈管內(nèi)癌栓形成的結(jié)直腸腺癌患者,其CDX2高表達率低于無脈管內(nèi)癌栓形成患者,而55例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中CDX2高表達率也低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者;說明CDX2蛋白表達與結(jié)直腸腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系;這也反過來證明了CDX2高表達具有抑制結(jié)直腸腺癌進展的作用,CDX2蛋白下調(diào)可提高結(jié)直腸腺癌的惡性程度和轉(zhuǎn)移能力,進一步證實CDX2是一種抑癌基因。有學(xué)者[16-18]認為CDX2過表達時能逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而抑制胃癌、腸癌細胞遷移、侵襲,因此推測結(jié)直腸腺癌CDX2表達缺失可能通過促進癌組織發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致侵襲能力的增強及血管和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生,但該假設(shè)還需要進一步深入研究。
此外,EGFR蛋白高表達的結(jié)直腸腺癌中,CDX2蛋白多呈低表達,比例高達86.89%,而EGFR蛋白低表達的結(jié)直腸腺癌患者,其CDX2蛋白82.57%呈高表達,似乎提示EGFR與CDX2蛋白表達存在負相關(guān),不過Spearman相關(guān)分析及χ2檢驗均未證實該推測。分析原因,可能與EGFR及CDX2參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的途徑存在不同通路有關(guān),但這還有待于大樣本數(shù)據(jù)進行分析和深入研究。總之,探討多個結(jié)直腸腺癌相關(guān)基因的表達及其相互關(guān)系,才能更全面的了解其發(fā)生發(fā)展和預(yù)后,以期為臨床診療和篩選高危人群提供重要的參考意義。