劉艷婷，于晶，王紅偉，于小玲

（青島大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 生理與病理生理學系，山東 青島 266021）

姜黃素（Curcumin, Cur）是從姜科植物姜黃的根莖中分離出來的一種多酚類物質(zhì)，作為一種天然的著色劑和調(diào)味劑添加在食品中，后期研究發(fā)現(xiàn)姜黃素還具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗菌等多種生物學作用[1-2]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素灌胃對順鉑[3]、外源性一氧化碳NO，以及阿托品[4]造成的小鼠胃腸功能障礙均有顯著的改善作用。進一步研究顯示姜黃素可通過促進乙酰膽堿（Acetylcholine, Ach）釋放而改善順鉑所致的胃排空障礙[3]。姜黃素對單純功能性胃排空障礙是否也通過Ach途徑發(fā)揮改善作用需要進一步確認。因Ach釋放后迅速被乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase, AchE）水解成膽堿和乙酸，所以本研究通過檢測小鼠胃組織中膽堿的數(shù)量變化得到AchE活力，從而反映Ach的釋放量。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑

健康昆明種雄性小鼠54只，體重20～22 g，購自山東省魯抗醫(yī)藥股份有限公司質(zhì)檢中心實驗動物室。姜黃素（純度99.9%）、鹽酸左旋精氨酸（L-精氨酸）購自美國Sigma-Aldrich公司，阿托品注射液購自天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司，AchE試劑盒購自南京建成生物工程研究所，RNA提取試劑盒購自美國Omega公司，逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購自瑞士羅氏生物科技有限公司，AchE、GADPH引物由上海生工生物有限公司設(shè)計合成，免疫印記技術(shù)測定的試劑購自美國Sigma公司，AchE（Cat.NO.bs-2511R）、β-actin抗體（Cat.NO.bs-0061R）購自中國Bioss公司。姜黃素與5%質(zhì)量分數(shù)的阿拉伯膠溶液配成濃度為25 g/L的混懸液，L-精氨酸使用時與5%質(zhì)量分數(shù)的阿拉伯膠溶液配成濃度為250 g/L的混懸液。阿托品與生理鹽水配成0.075 g/L的混合液。

1.2 動物分組與處理

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組、姜黃素組、L-精氨酸組、阿托品組、姜黃素+L-精氨酸聯(lián)合組、姜黃素+阿托品聯(lián)合組，共6組，每組9只。對照組、L-精氨酸組、阿托品組給予溶媒溶液灌胃，1次/d，0.2 ml/次，共15 d。姜黃素組、姜黃素+（L-精氨酸）聯(lián)合組、姜黃素+阿托品聯(lián)合組給予姜黃素（200 mg/kg）混懸液灌胃，1次/d，0.2 ml/次，共15 d。從灌胃的第11天開始，L-精氨酸組、姜黃素+（L-精氨酸）聯(lián)合組分別給予0.2 ml L-精氨酸（2 g/kg）混懸液灌胃，1次/d，0.2 ml/次，共5 d。阿托品組、姜黃素+阿托品聯(lián)合組于小鼠測量胃排空前40 min腹腔注射阿托品（0.5 mg/kg）混合液1次。其余組給予等量溶媒溶液灌胃及生理鹽水腹腔注射作為對照。

1.3 胃排空率的檢測

在末次灌胃結(jié)束后，各組小鼠禁食24 h并自由飲水，處死小鼠前20 min時，分別給予0.8 ml 80%質(zhì)量分數(shù)的亞甲藍混懸液灌胃。脫臼處死小鼠并腹腔解剖，結(jié)扎胃賁門部和幽門部，切取胃并稱其全質(zhì)量，然后洗去胃內(nèi)容物，再次稱取胃凈質(zhì)量，計算胃排空率。胃排空率（%）=1-（胃全質(zhì)量-胃凈質(zhì)量）/0.8 ml亞甲藍混懸液質(zhì)量×100%。

1.4 胃組織AchE活力的檢測

分別取各組小鼠的新鮮胃組織，用高通量組織勻漿機研磨成10%體積分數(shù)的組織勻漿，低溫離心后取上清液。嚴格按照AchE試劑盒說明書進行操作，反應(yīng)結(jié)束后將最終顯色的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到96孔板，使用全自動酶標儀檢測在波長412 nm時的吸光度值，然后根據(jù)每毫克組織蛋白計算組織勻漿中AchE活力。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)對胃組織AchE mRNA的檢測

取冷藏于-80℃冰箱的各組胃組織50 mg，用硅膠柱純化方式提取胃組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用LightMix?試劑盒進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR），以GAPDH作為內(nèi)參。反應(yīng)條件為 ：95℃ 3 min，95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)。每樣本采用3管，計算其平均Ct值。采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。AchE正向引物：5'-ACCTGCTTCTCCCACACCT-3'，反向引物：5'-GGTTCCCACTCGGTAGTTCA-3'；內(nèi)參照GAPDH基因正向引物：5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'，反向引物：5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'。

1.6 Western blot法檢測AchE

提取各組小鼠胃組織蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。將轉(zhuǎn)移好的PVDF膜浸入脫脂奶粉中以阻止后續(xù)非特異性結(jié)合；PBST洗滌3次后用AchE抗體孵育1 h（37℃）；再用同樣方法洗滌、孵育二抗；洗滌之后在PVDF膜上滴加DAB發(fā)光染色液，在數(shù)碼冷光成像分析系統(tǒng)中成像，然后分析條帶灰度值，并與相應(yīng)β-actin的灰度值比較得到相對值。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊的條件，組間兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對L-精氨酸所致的小鼠胃排空障礙及AchE的影響

與對照組比較，L-精氨酸組小鼠胃排空率降低（t=4.684，P=0.000），AchE mRNA、AchE蛋白表達及AchE活力均下降（t=7.250、6.626和4.933，均P=0.000）；與L-精氨酸組比較，姜黃素+（L-精氨酸）聯(lián)合組小鼠胃排空率改善（t=3.153，P=0.003），AchE mRNA、AchE蛋白表達及AchE活力均升高（t=4.165、3.718 和 2.936，P=0.000、0.001 和 0.007）；姜黃素 +（L-精氨酸）聯(lián)合組與對照組比較上述指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。單用姜黃素組與對照組比較上述指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1和附圖。

2.2 姜黃素對阿托品所致的小鼠胃排空障礙及AchE的影響

由表2和附圖可見，與對照組比較，阿托品組胃排空率降低（t=6.855，P=0.000），其AchE mRNA、AchE蛋白表達及AchE活力均降低（t=6.559、5.454和4.094，均P=0.000）；與阿托品組比較，姜黃素+阿托品聯(lián)合組胃排空率改善（t=6.398，P=0.000），其AchE mRNA、AchE蛋白表達及AchE活力均升高（t=3.204、2.978和3.827，P=0.005、0.010和0.003），上述指標雖未完全恢復至正常，但與對照組比較差異已無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。單用姜黃素組與對照組比較上述指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 姜黃素對L-精氨酸所致的小鼠胃排空及 AchE 的影響 （n =9，±s）

AchE活力/（u/mg）對照組 68.94±10.96 1.00±0.20 0.78±0.13姜黃素組 62.00±13.84 0.89±0.20 0.70±0.16 L-精氨酸組 41.43±13.78 0.47±0.09 0.50±0.11姜黃素+（L-精氨酸）聯(lián)合組 60.32±11.54 0.80±0.22 0.69±0.19組別 胃排空率/% AchE mRNA表達F值 8.440 18.348 6.395 P值 0.000 0.000 0.002

表2 姜黃素對阿托品所致的小鼠胃排空率及 AchE 的影響 （n =9，±s）

表2 姜黃素對阿托品所致的小鼠胃排空率及 AchE 的影響 （n =9，±s）

AchE 活力/（u/mg）對照組 68.94±10.96 1.00±0.15 0.77±0.14姜黃素組 62.00±13.84 0.93±0.20 0.74±0.18阿托品 37.77±8.12 0.58±0.12 0.49±0.15姜黃素+阿托品聯(lián)合組 63.75±9.08 0.82±0.19 0.72±0.10 F值 14.539 18.348 7.241 P值 0.000 0.000 0.001組別 胃排空率/%AchE mRNA表達

附圖 各組小鼠胃組織中AchE蛋白表達

3 討論

L-精氨酸和阿托品均可造成功能性胃腸蠕動障礙。其中L-精氨酸是NO前體，在體內(nèi)被一氧化氮合酶（nitricoxide synthase, NOS）催化生成NO，NO由鳥苷酸環(huán)化酶激活經(jīng)環(huán)磷酸鳥苷[5]，作用于化學門控的鈣釋放通道，引起細胞內(nèi)Ca2+庫釋放的Ca2+減少，從而松弛胃腸道平滑肌，抑制胃腸道蠕動。也有研究認為NO可直接抑制Ach的釋放而起松弛平滑肌的作用[6]。阿托品作為M膽堿受體阻斷劑能夠阻斷Ach與相應(yīng)受體結(jié)合，從而使胃腸平滑肌松弛，降低胃腸蠕動的頻率和幅度，從而使胃腸蠕動障礙。兩者造成胃腸蠕動障礙均與Ach有關(guān)，Ach作為胃腸的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，由神經(jīng)末梢釋放后，與M膽堿能受體結(jié)合，激活G蛋白[7]與磷脂酶C結(jié)合分解生成第二信使，從而參加一系列級聯(lián)反應(yīng)，引起細胞內(nèi)Ca2+增加，引起平滑肌收縮[8]。與膽堿受體結(jié)合后和未與膽堿受體結(jié)合的Ach迅速被AchE水解成膽堿和乙酸被回收到神經(jīng)末梢作為生成Ach的原料。本研究中采用的試劑盒就是通過檢測膽堿的數(shù)量得到AchE的活力，從而反映Ach的釋放量。結(jié)果顯示，在L-精氨酸和阿托品造成功能性胃排空障礙時，胃組織中AchE活力降低并且mRNA和蛋白的表達量下降，說明外源性NO和阿托品引起的胃排空障礙均與Ach釋放減少有關(guān)。給予姜黃素灌胃后可以顯著改善NO和阿托品所致的胃排空障礙，并且AchE的活力和mRNA以及蛋白表達均得到改善，說明姜黃素可能通過促使Ach釋放改善胃排空。

姜黃素在體內(nèi)如何增加胃組織Ach釋放目前尚不清楚。本實驗室以往研究顯示在順鉑造成的胃腸損傷中，姜黃素可抑制小鼠胃組織NOS的活性從而減少NO的產(chǎn)生[9]，姜黃素抑制NO產(chǎn)生的作用在其他研究中同樣得到驗證[10-11]。如前所述，NO可以抑制Ach而松弛平滑肌[6，12]，因而推測在L-精氨酸模型中，姜黃素可能是通過抑制胃組織NO產(chǎn)生進而增加Ach釋放，從而改善胃排空，這可能是姜黃素發(fā)揮作用的機制之一。在阿托品模型中，姜黃素預先灌胃使Ach釋放量增加的具體機制尚不清楚，但是姜黃素對多種疾病模型中Ach以及AchE的研究有類似報道。服用姜黃素的大鼠可提高機體中谷胱甘肽水平及AchE活性，可以減輕秋水仙素引起的大鼠因脂質(zhì)過氧化而產(chǎn)生的認知功能障礙[13]。姜黃素可使鎘中毒小鼠腦內(nèi)AchE的活力顯著提高并且呈現(xiàn)劑量依賴性[14]。姜黃素還促進大鼠腦組織Ach釋放，這是改善因β-淀粉樣蛋白誘導的炎癥反應(yīng)所致的阿爾茨海默病的機制之一[15]。

綜上所述，在外源性NO和阿托品造成的兩種功能性胃排空障礙的模型中，姜黃素均可通過影響Ach的釋放而改善小鼠的胃排空，這也為將來姜黃素對胃腸功能的研究提供思路。姜黃素的藥理作用廣而毒副作用小，近期又制備出了提高姜黃素溶解性的復合材料[16]，相信未來一定有廣闊的前景。