周昱

（江蘇省無錫市第二人民醫(yī)院 普外科，江蘇 無錫 214000）

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，每年我國該病患者占全球新發(fā)病例的18.6%，并逐年上升[1]。研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9,MMP-9）和Ets轉(zhuǎn)錄因子1（E-twenty six transcription factor-1, Ets-1）在結(jié)腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)過程中起了重要作用[2-5]。細(xì)絲蛋白A（filamin A, FLNa）能夠削弱結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲力，對(duì)結(jié)腸癌的發(fā)生有抑制作用[6]。但目前關(guān)于MMP-9與Ets-1、FLNa在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其相關(guān)性的研究較少，因此本研究通過對(duì)正常組織及不同分化程度的癌組織中MMP-9與Ets-1、FLNa表達(dá)水平進(jìn)行分析研究，探討其在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2010年10月-2015年4月本院確診為結(jié)腸癌并行手術(shù)治療的患者24例。其中，男性13例，年齡30～75歲，平均（52.67±7.76）歲；女性11例，年齡32～78歲，平均（53.32±7.48）歲。結(jié)腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)術(shù)后病理學(xué)檢查結(jié)果。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：①合并其他惡性腫瘤；②術(shù)前接受放療、化療；③存在手術(shù)禁忌證的患者；④病歷資料不完整。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 所有患者均進(jìn)行腫瘤切除手術(shù)，術(shù)中采集患者腫瘤組織、癌旁組織及正常結(jié)腸組織作為研究樣本，采用病理學(xué)檢查確定腫瘤組織的大小、Dukes分期[7]、分化程度情況，術(shù)后隨訪是否有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，并進(jìn)行記錄分析。

1.2.2 相關(guān)指標(biāo)檢測 將術(shù)中取得的組織剪碎，放入1～2 ml勻漿器中，加入400 μl裂解液，使用勻漿器反復(fù)勻漿，裂解30 min后，將裂解液移入1.5 ml離心管，在4℃,12 000 r/min，離心5 min，取上清液置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩＿x用人MMP-9檢測試劑盒、人FLNa檢測試劑盒（上海百蕊生物科技有限公司提供），利用全自動(dòng)酶標(biāo)儀318C（Peiou，上海沛歐分析儀器有限公司提供），通過ELISA測定各組織上清液中MMP-9蛋白、FLNa的表達(dá)情況。采用Trizol法提取研究對(duì)象的總RNA，利用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量定量PCR儀測定各組織中Ets-1的表達(dá)水平，以2-ΔΔCt值＞2為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，或方差分析（兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)），相關(guān)性分析采用Pearson法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常結(jié)腸組織、癌旁組織及腫瘤組織中MMP-9、Ets-1與FLNa表達(dá)水平比較

各組織中MMP-9和Ets-1表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表達(dá)水平由高到低依次為，腫瘤組織＞癌旁組織＞正常結(jié)腸組織；各組織中FLNa表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表達(dá)水平由低到高依次為，腫瘤組織＜癌旁組織＜正常結(jié)腸組織。見表1。

表1 正常結(jié)腸組織、癌旁組織及腫瘤組織中MMP-9、Ets-1與FLNa表達(dá)水平比較 （n =24，±s）

表1 正常結(jié)腸組織、癌旁組織及腫瘤組織中MMP-9、Ets-1與FLNa表達(dá)水平比較 （n =24，±s）

注：1）與正常結(jié)腸組織比較，P ＜0.05；2）與癌旁組織比較，P ＜0.05

組別 MMP-9/（ng/ml） FLNa/（ng/ml） Ets-1（2-ΔΔCt）正常結(jié)腸組織 20.28±5.22 147.27±21.47 1.02±0.15癌旁組織 195.38±24.461） 64.28±8.361） 3.74±0.521）腫瘤組織 482.38±68.261）2） 19.37±2.381）2） 6.38±0.841）2）F值 92.687 70.630 64.744 P值 0.000 0.000 0.000

表2 腫瘤組織的臨床病理指標(biāo)與MMP-9、Ets-1及FLNa表達(dá)水平的關(guān)系 （±s）

表2 腫瘤組織的臨床病理指標(biāo)與MMP-9、Ets-1及FLNa表達(dá)水平的關(guān)系 （±s）

F L N a/（n g/m l）臨床指標(biāo) 例數(shù) M M P-9/（n g/m l）E t s-1（2-ΔΔCt）腫瘤直徑≥ 5 c m 1 1 7.0 2±1.1 1 5 2 6.3 7±7 8.7 2 1 3.4 7±1.4 5＜5 c m 1 3 5.2 7±0.9 4 4 4 9.2 9±6 2.3 7 2 5.3 8±4.1 8 t值 4.1 8 5 2.6 7 7 8.9 7 8 P值 0.0 0 4 0.0 1 4 0.0 0 0 F L N a/（n g/m l）分化程度高分化 1 0 4.9 2±0.7 4 4 3 7.4 4±6 2.1 2 5.3 7±3.6 5中低分化 1 4 7.2 6±1.1 2 5 1 3.4 5±7 2.1 4 1 4.6 6±2.0 6 t值 5.7 5 3 2.6 9 1 9.1 7 0 P值 0.0 0 0 0.0 1 3 0.0 0 0臨床指標(biāo) 例數(shù) M M P-9/（n g/m l）E t s-1（2-ΔΔCt）

表2 腫瘤組織的臨床病理指標(biāo)與MMP-9、Ets-1及FLNa表達(dá)水平的關(guān)系 （±s）

表2 腫瘤組織的臨床病理指標(biāo)與MMP-9、Ets-1及FLNa表達(dá)水平的關(guān)系 （±s）

FLNa/（ng/ml）臨床指標(biāo) 例數(shù) MMP-9/（ng/ml）Ets-1（2-ΔΔCt）Dukes分期A 期 7 4.72±0.63 408.27±57.28 26.37±4.13 B 期 6 5.32±0.73 437.21±63.68 24.35±4.68 C 期 7 6.47±0.85 472.84±65.77 19.33±2.96 D 期 4 7.15±1.03 517.67±74.29 13.41±1.64 F值 5.330 1.556 7.267 P值 0.026 0.274 0.011 FLNa/（ng/ml）術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有12 7.09±0.93 519.56±69.77 13.57±1.69無12 5.02±0.76 432.46±59.89 24.89±3.57 t值 5.970 3.281 9.928 P值 0.000 0.003 0.000臨床指標(biāo) 例數(shù) MMP-9/（ng/ml）Ets-1（2-ΔΔCt）

2.2 腫瘤組織的臨床病理指標(biāo)與MMP-9、ETS-1及FLNa表達(dá)水平的關(guān)系

本研究顯示，MMP-9與FLNa的表達(dá)與腫瘤直徑、Dukes分期、分化程度、術(shù)后有無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Ets-1的表達(dá)與腫瘤直徑、分化程度、術(shù)后有無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與Dukes分期無關(guān)。見表2。

2.3 正常結(jié)腸組織、癌旁組織及腫瘤組織中MMP-9與Ets-1、FLNa表達(dá)的相關(guān)性

本研究顯示，在癌旁組織及腫瘤組織中，MMP-9與 Ets-1表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05），MMP-9與 FLNa表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），Ets-1與FLNa表達(dá)無相關(guān)性（P＞0.05）。見表 3。

表3 正常結(jié)腸組織、癌旁組織及腫瘤組織中MMP-9與Ets-1、FLNa表達(dá)相關(guān)性分析 （n =24，±s）

表3 正常結(jié)腸組織、癌旁組織及腫瘤組織中MMP-9與Ets-1、FLNa表達(dá)相關(guān)性分析 （n =24，±s）

MMP-9與Ets-1 MMP-9與FLNa Ets-1與FLNa相關(guān)系數(shù)r P值 相關(guān)系數(shù)r P值 相關(guān)系數(shù)r P值正常結(jié)腸組織 0.045 0.758 0.026 0.825 0.026 0.825癌旁組織 0.847 0.000 -0.735 0.001 -0.236 0.135腫瘤組織 0.829 0.000 -0.858 0.000 -0.287 0.126組別

3 討論

近年來，隨著人們生活方式的不斷改變，我國結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年增高，已成為僅次于胃癌的第二大消化道惡性腫瘤性疾病，且具有預(yù)后差、死亡率高的特點(diǎn)，給患者帶來較大的痛苦[8]。盡快的研究結(jié)腸癌的發(fā)病與進(jìn)展過程，并進(jìn)行適當(dāng)干預(yù)顯得尤為重要。目前，研究認(rèn)為[9]，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與多種基因的表達(dá)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[10]，MMP-9是鋅離子依賴性基質(zhì)金屬蛋白酶家族的一員，常由腫瘤細(xì)胞合成分泌，其對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)中的彈力蛋白和膠原蛋白具有降解作用，破壞細(xì)胞外基質(zhì)的完整性，有利于腫瘤細(xì)胞的侵襲，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移；另外，MMP-9還能調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的分泌，促進(jìn)腫瘤組織周圍血供的形成[11]。Ets-1是一種原癌基因，有資料顯示[12]其對(duì)與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的許多基因都有調(diào)控作用，促進(jìn)金屬蛋白酶家族的表達(dá)，摧毀周圍組織屏障，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性，還可以與血管生成因子相關(guān)的啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長相關(guān)因子分泌，加速血管新生，為腫瘤組織的血液循環(huán)提供基礎(chǔ)，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧的耐受力。FLNa是一種大分子的胞質(zhì)蛋白，與細(xì)胞內(nèi)多種腫瘤形成相關(guān)受體表達(dá)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，體外能夠阻斷MMP-9表達(dá)的信號(hào)通路，妨礙其表達(dá)，使細(xì)胞侵襲力降低[13]?，F(xiàn)有的研究表明[14]，MMP-9、Ets-1分別在多種惡性腫瘤組織中存在，并在腫瘤發(fā)展中其重要作用。

研究結(jié)果顯示，各組織中MMP-9與Ets-1表達(dá)水平，腫瘤組織＞癌旁組織＞正常結(jié)腸組織，表明結(jié)腸癌的發(fā)生與MMP-9與Ets-1表達(dá)水平升高有關(guān)。曾有研究報(bào)道[15]，對(duì)122例結(jié)腸癌患者血清及組織MMP-9水平進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者M(jìn)MP-9水平較高，且與其惡性程度有關(guān)；亦有研究發(fā)現(xiàn)，在正常結(jié)腸、息肉中Ets-1無表達(dá)，而在不典型增生腺瘤、結(jié)腸癌中Ets-1表達(dá)升高[16]，這與本研究結(jié)果相一致。各組織中FLNa表達(dá)水平，腫瘤組織＜癌旁組織＜正常結(jié)腸組織，提示FLNa在腫瘤組織中表達(dá)受到抑制，無法對(duì)腫瘤發(fā)展發(fā)揮阻礙作用。

MMP-9、Ets-1的表達(dá)水平還與腫瘤組織的臨床病理指標(biāo)有關(guān)，直徑≥5 cm的腫瘤組織中MMP-9、Ets-1表達(dá)水平高于直徑＜5 cm的腫瘤組織，Ets-1能夠調(diào)控MMP-9基因的表達(dá)，促進(jìn)MMP-9合成分泌，破壞周圍正常的細(xì)胞基質(zhì)，解除其對(duì)腫瘤組織的限制，促進(jìn)腫瘤生長擴(kuò)張；不同Dukes分期的腫瘤組織中MMP-9、Ets-1表達(dá)水平比較，A期＜B期＜C期＜D期，Dukes分期越高，表明腫瘤侵襲的深度越大，周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的范圍越廣，這可能與MMP-9、Ets-1協(xié)同促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子分泌，為腫瘤組織建立豐富血運(yùn)，腫瘤組織增大的同時(shí)出現(xiàn)血行播散轉(zhuǎn)移有關(guān)；高分化腫瘤組織中MMP-9、Ets-1表達(dá)水平低于中低分化的腫瘤組織，腫瘤的分化程度越低，MMP-9、Ets-1表達(dá)越高，腫瘤的侵襲能力越強(qiáng)，惡性程度更高，預(yù)后不佳；術(shù)后有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中MMP-9、Ets-1表達(dá)水平高于術(shù)后無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織，提示MMP-9和Ets-1的高表達(dá)提高中路侵襲性，同時(shí)破壞正常組織的防御，及時(shí)切除原有腫瘤組織，還易再次復(fù)發(fā)[17]。腫瘤直徑越大、Dukes分期越嚴(yán)重、分化程度越低、術(shù)后有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，F(xiàn)LNa表達(dá)水平越低，在腫瘤組織中，F(xiàn)LNa表達(dá)受到抑制，EPK1磷酸化不受影響，Ras/EPR通路激活，促進(jìn)Ets家族與MMP-9結(jié)合位點(diǎn)的相互作用，引起MMP-9高表達(dá)，使得腫瘤細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)[18]。

研究結(jié)果顯示，在正常結(jié)腸組織中，MMP-9與Ets-1極少表達(dá)；在癌旁組織及腫瘤組織中，MMP-9與Ets-1表達(dá)呈正相關(guān)，表明MMP-9與Ets-1可能有協(xié)同作用。有資料顯示[19]，MMP-9基因的啟動(dòng)子區(qū)包含Ets結(jié)合位點(diǎn)，過度表達(dá)的Ets-1能夠與之結(jié)合，進(jìn)一步促進(jìn)MMP-9表達(dá)，降低周圍正常組織細(xì)胞黏附力，有助于腫瘤細(xì)胞侵襲，兩者共同促進(jìn)血管新生，為腫瘤組織提供營養(yǎng)支持。MMP-9與FLNa表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明FLNa表達(dá)減少，使得其對(duì)MMP-9的負(fù)面影響減輕，喪失抑制癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的能力。

本實(shí)驗(yàn)顯示，在結(jié)腸癌組織中，MMP-9與Ets-1的表達(dá)呈正相關(guān)，與FLNa表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，MMP-9、Ets-1表達(dá)水平升高，F(xiàn)LNa表達(dá)水平降低，其可能參與結(jié)腸癌的發(fā)生、形成、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等環(huán)節(jié)。在下一步研究中，可對(duì)結(jié)腸癌MMP-9、Ets-1與FLNa的基因靶向治療進(jìn)行探討。