周昱
(江蘇省無錫市第二人民醫(yī)院 普外科,江蘇 無錫 214000)
結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤,每年我國該病患者占全球新發(fā)病例的18.6%,并逐年上升[1]。研究發(fā)現(xiàn),基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)和Ets轉錄因子1(E-twenty six transcription factor-1, Ets-1)在結腸癌的侵襲、轉移和術后復發(fā)過程中起了重要作用[2-5]。細絲蛋白A(filamin A, FLNa)能夠削弱結腸癌細胞的侵襲力,對結腸癌的發(fā)生有抑制作用[6]。但目前關于MMP-9與Ets-1、FLNa在結腸癌組織中的表達及其相關性的研究較少,因此本研究通過對正常組織及不同分化程度的癌組織中MMP-9與Ets-1、FLNa表達水平進行分析研究,探討其在結腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及相關性。
選取2010年10月-2015年4月本院確診為結腸癌并行手術治療的患者24例。其中,男性13例,年齡30~75歲,平均(52.67±7.76)歲;女性11例,年齡32~78歲,平均(53.32±7.48)歲。結腸癌診斷標準依據(jù)術后病理學檢查結果。排除標準包括:①合并其他惡性腫瘤;②術前接受放療、化療;③存在手術禁忌證的患者;④病歷資料不完整。
1.2.1 樣本采集 所有患者均進行腫瘤切除手術,術中采集患者腫瘤組織、癌旁組織及正常結腸組織作為研究樣本,采用病理學檢查確定腫瘤組織的大小、Dukes分期[7]、分化程度情況,術后隨訪是否有復發(fā)轉移,并進行記錄分析。
1.2.2 相關指標檢測 將術中取得的組織剪碎,放入1~2 ml勻漿器中,加入400 μl裂解液,使用勻漿器反復勻漿,裂解30 min后,將裂解液移入1.5 ml離心管,在4℃,12 000 r/min,離心5 min,取上清液置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。選用人MMP-9檢測試劑盒、人FLNa檢測試劑盒(上海百蕊生物科技有限公司提供),利用全自動酶標儀318C(Peiou,上海沛歐分析儀器有限公司提供),通過ELISA測定各組織上清液中MMP-9蛋白、FLNa的表達情況。采用Trizol法提取研究對象的總RNA,利用ABI 7500實時熒光定量定量PCR儀測定各組織中Ets-1的表達水平,以2-ΔΔCt值>2為有統(tǒng)計學意義。
數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,比較采用t檢驗,或方差分析(兩兩比較用LSD-t檢驗),相關性分析采用Pearson法,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
各組織中MMP-9和Ets-1表達水平比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表達水平由高到低依次為,腫瘤組織>癌旁組織>正常結腸組織;各組織中FLNa表達水平比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表達水平由低到高依次為,腫瘤組織<癌旁組織<正常結腸組織。見表1。
表1 正常結腸組織、癌旁組織及腫瘤組織中MMP-9、Ets-1與FLNa表達水平比較 (n =24,±s)
表1 正常結腸組織、癌旁組織及腫瘤組織中MMP-9、Ets-1與FLNa表達水平比較 (n =24,±s)
注:1)與正常結腸組織比較,P <0.05;2)與癌旁組織比較,P <0.05
組別 MMP-9/(ng/ml) FLNa/(ng/ml) Ets-1(2-ΔΔCt)正常結腸組織 20.28±5.22 147.27±21.47 1.02±0.15癌旁組織 195.38±24.461) 64.28±8.361) 3.74±0.521)腫瘤組織 482.38±68.261)2) 19.37±2.381)2) 6.38±0.841)2)F值 92.687 70.630 64.744 P值 0.000 0.000 0.000
表2 腫瘤組織的臨床病理指標與MMP-9、Ets-1及FLNa表達水平的關系 (±s)
表2 腫瘤組織的臨床病理指標與MMP-9、Ets-1及FLNa表達水平的關系 (±s)
F L N a/(n g/m l)臨床指標 例數(shù) M M P-9/(n g/m l)E t s-1(2-ΔΔCt)腫瘤直徑≥ 5 c m 1 1 7.0 2±1.1 1 5 2 6.3 7±7 8.7 2 1 3.4 7±1.4 5<5 c m 1 3 5.2 7±0.9 4 4 4 9.2 9±6 2.3 7 2 5.3 8±4.1 8 t值 4.1 8 5 2.6 7 7 8.9 7 8 P值 0.0 0 4 0.0 1 4 0.0 0 0 F L N a/(n g/m l)分化程度高分化 1 0 4.9 2±0.7 4 4 3 7.4 4±6 2.1 2 5.3 7±3.6 5中低分化 1 4 7.2 6±1.1 2 5 1 3.4 5±7 2.1 4 1 4.6 6±2.0 6 t值 5.7 5 3 2.6 9 1 9.1 7 0 P值 0.0 0 0 0.0 1 3 0.0 0 0臨床指標 例數(shù) M M P-9/(n g/m l)E t s-1(2-ΔΔCt)
表2 腫瘤組織的臨床病理指標與MMP-9、Ets-1及FLNa表達水平的關系 (±s)
表2 腫瘤組織的臨床病理指標與MMP-9、Ets-1及FLNa表達水平的關系 (±s)
FLNa/(ng/ml)臨床指標 例數(shù) MMP-9/(ng/ml)Ets-1(2-ΔΔCt)Dukes分期A 期 7 4.72±0.63 408.27±57.28 26.37±4.13 B 期 6 5.32±0.73 437.21±63.68 24.35±4.68 C 期 7 6.47±0.85 472.84±65.77 19.33±2.96 D 期 4 7.15±1.03 517.67±74.29 13.41±1.64 F值 5.330 1.556 7.267 P值 0.026 0.274 0.011 FLNa/(ng/ml)術后復發(fā)轉移有12 7.09±0.93 519.56±69.77 13.57±1.69無12 5.02±0.76 432.46±59.89 24.89±3.57 t值 5.970 3.281 9.928 P值 0.000 0.003 0.000臨床指標 例數(shù) MMP-9/(ng/ml)Ets-1(2-ΔΔCt)
本研究顯示,MMP-9與FLNa的表達與腫瘤直徑、Dukes分期、分化程度、術后有無復發(fā)轉移有關。Ets-1的表達與腫瘤直徑、分化程度、術后有無復發(fā)轉移有關,與Dukes分期無關。見表2。
本研究顯示,在癌旁組織及腫瘤組織中,MMP-9與 Ets-1表達呈正相關(P<0.05),MMP-9與 FLNa表達呈負相關(P<0.05),Ets-1與FLNa表達無相關性(P>0.05)。見表 3。
表3 正常結腸組織、癌旁組織及腫瘤組織中MMP-9與Ets-1、FLNa表達相關性分析 (n =24,±s)
表3 正常結腸組織、癌旁組織及腫瘤組織中MMP-9與Ets-1、FLNa表達相關性分析 (n =24,±s)
MMP-9與Ets-1 MMP-9與FLNa Ets-1與FLNa相關系數(shù)r P值 相關系數(shù)r P值 相關系數(shù)r P值正常結腸組織 0.045 0.758 0.026 0.825 0.026 0.825癌旁組織 0.847 0.000 -0.735 0.001 -0.236 0.135腫瘤組織 0.829 0.000 -0.858 0.000 -0.287 0.126組別
近年來,隨著人們生活方式的不斷改變,我國結腸癌的發(fā)病率逐年增高,已成為僅次于胃癌的第二大消化道惡性腫瘤性疾病,且具有預后差、死亡率高的特點,給患者帶來較大的痛苦[8]。盡快的研究結腸癌的發(fā)病與進展過程,并進行適當干預顯得尤為重要。目前,研究認為[9],腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與多種基因的表達有關。研究發(fā)現(xiàn)[10],MMP-9是鋅離子依賴性基質金屬蛋白酶家族的一員,常由腫瘤細胞合成分泌,其對細胞外基質中的彈力蛋白和膠原蛋白具有降解作用,破壞細胞外基質的完整性,有利于腫瘤細胞的侵襲,促進腫瘤轉移;另外,MMP-9還能調控血管內皮細胞生長因子的分泌,促進腫瘤組織周圍血供的形成[11]。Ets-1是一種原癌基因,有資料顯示[12]其對與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關的許多基因都有調控作用,促進金屬蛋白酶家族的表達,摧毀周圍組織屏障,增強腫瘤細胞的侵襲性,還可以與血管生成因子相關的啟動子結合,促進血管內皮細胞生長相關因子分泌,加速血管新生,為腫瘤組織的血液循環(huán)提供基礎,提高腫瘤細胞對缺氧的耐受力。FLNa是一種大分子的胞質蛋白,與細胞內多種腫瘤形成相關受體表達及信號轉導有關,體外能夠阻斷MMP-9表達的信號通路,妨礙其表達,使細胞侵襲力降低[13]。現(xiàn)有的研究表明[14],MMP-9、Ets-1分別在多種惡性腫瘤組織中存在,并在腫瘤發(fā)展中其重要作用。
研究結果顯示,各組織中MMP-9與Ets-1表達水平,腫瘤組織>癌旁組織>正常結腸組織,表明結腸癌的發(fā)生與MMP-9與Ets-1表達水平升高有關。曾有研究報道[15],對122例結腸癌患者血清及組織MMP-9水平進行檢測,結果發(fā)現(xiàn)結腸癌患者MMP-9水平較高,且與其惡性程度有關;亦有研究發(fā)現(xiàn),在正常結腸、息肉中Ets-1無表達,而在不典型增生腺瘤、結腸癌中Ets-1表達升高[16],這與本研究結果相一致。各組織中FLNa表達水平,腫瘤組織<癌旁組織<正常結腸組織,提示FLNa在腫瘤組織中表達受到抑制,無法對腫瘤發(fā)展發(fā)揮阻礙作用。
MMP-9、Ets-1的表達水平還與腫瘤組織的臨床病理指標有關,直徑≥5 cm的腫瘤組織中MMP-9、Ets-1表達水平高于直徑<5 cm的腫瘤組織,Ets-1能夠調控MMP-9基因的表達,促進MMP-9合成分泌,破壞周圍正常的細胞基質,解除其對腫瘤組織的限制,促進腫瘤生長擴張;不同Dukes分期的腫瘤組織中MMP-9、Ets-1表達水平比較,A期<B期<C期<D期,Dukes分期越高,表明腫瘤侵襲的深度越大,周圍淋巴結轉移及遠處器官轉移的范圍越廣,這可能與MMP-9、Ets-1協(xié)同促進血管內皮細胞生長因子分泌,為腫瘤組織建立豐富血運,腫瘤組織增大的同時出現(xiàn)血行播散轉移有關;高分化腫瘤組織中MMP-9、Ets-1表達水平低于中低分化的腫瘤組織,腫瘤的分化程度越低,MMP-9、Ets-1表達越高,腫瘤的侵襲能力越強,惡性程度更高,預后不佳;術后有復發(fā)轉移的腫瘤組織中MMP-9、Ets-1表達水平高于術后無復發(fā)轉移的腫瘤組織,提示MMP-9和Ets-1的高表達提高中路侵襲性,同時破壞正常組織的防御,及時切除原有腫瘤組織,還易再次復發(fā)[17]。腫瘤直徑越大、Dukes分期越嚴重、分化程度越低、術后有復發(fā)轉移,F(xiàn)LNa表達水平越低,在腫瘤組織中,F(xiàn)LNa表達受到抑制,EPK1磷酸化不受影響,Ras/EPR通路激活,促進Ets家族與MMP-9結合位點的相互作用,引起MMP-9高表達,使得腫瘤細胞侵襲能力增強[18]。
研究結果顯示,在正常結腸組織中,MMP-9與Ets-1極少表達;在癌旁組織及腫瘤組織中,MMP-9與Ets-1表達呈正相關,表明MMP-9與Ets-1可能有協(xié)同作用。有資料顯示[19],MMP-9基因的啟動子區(qū)包含Ets結合位點,過度表達的Ets-1能夠與之結合,進一步促進MMP-9表達,降低周圍正常組織細胞黏附力,有助于腫瘤細胞侵襲,兩者共同促進血管新生,為腫瘤組織提供營養(yǎng)支持。MMP-9與FLNa表達呈負相關,表明FLNa表達減少,使得其對MMP-9的負面影響減輕,喪失抑制癌細胞增殖、轉移的能力。
本實驗顯示,在結腸癌組織中,MMP-9與Ets-1的表達呈正相關,與FLNa表達呈負相關,MMP-9、Ets-1表達水平升高,F(xiàn)LNa表達水平降低,其可能參與結腸癌的發(fā)生、形成、轉移、復發(fā)等環(huán)節(jié)。在下一步研究中,可對結腸癌MMP-9、Ets-1與FLNa的基因靶向治療進行探討。