隋 雙， 王 萍

(東北林業(yè)大學 林學院， 黑龍江 哈爾濱 150040)

篤斯越橘(VacciniumuliginosumL.)是我國重要的野生資源之一，主要分布在內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、遼寧等地區(qū)[1]。它是一種果肉細膩、種子極小的小漿果。果實不僅營養(yǎng)豐富，而且含有有機酸、氨基酸、花色苷等獨特的功能性成分[2]，具有防治心血管疾病、抗癌、抗衰老等多種功效[3-4]。

篤斯越橘極不耐貯藏，其深加工研究有利于緩解該產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。Sang等[5]研究結(jié)果表明，發(fā)酵過程可顯著提高原料本身的抗氧化能力。發(fā)酵引起復合物底物分解和生物轉(zhuǎn)化成相容的組分，從而調(diào)節(jié)產(chǎn)物性質(zhì)或改變某些生物活性化合物的量[6]。用酵母控制發(fā)酵果汁，可長期保存其所有生物活性化合物(如抗氧化劑)和功能性物質(zhì)[7]。乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生不同的代謝物，如有機酸、二氧化碳、乙醇、過氧化氫、二乙酰、細菌素、胞外多糖、風味成分、酶和營養(yǎng)物質(zhì)[8]。植物乳桿菌能夠進行乳酸發(fā)酵，特別是在高pH值條件下與酵母共接種[9]。醋酸菌可將乙醇氧化為醋酸，醋酸菌的加入將有效降低酒精發(fā)酵階段所產(chǎn)生的乙醇含量。目前，同時接種酵母菌、植物乳桿菌和醋酸菌進行混合發(fā)酵篤斯越橘的研究鮮有報道。

本研究選用果酒酵母、植物乳桿菌和醋酸菌3種益生菌混合發(fā)酵篤斯越橘，采用Box-Benhnken中心組合實驗優(yōu)化發(fā)酵工藝，旨在得到一種總酚含量和抗氧化能力較高的篤斯越橘低醇發(fā)酵產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

篤斯越橘，黑龍江省大興安嶺； MRS培養(yǎng)基，自制(用于植物乳桿菌的培養(yǎng))； GY培養(yǎng)基，自制(用于醋酸菌的培養(yǎng))；脫氧核糖、2-硫代巴比妥酸、TPTZ ，上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純或生物制劑。

1.2 實驗菌種

葡萄酒·果酒專用酵母(Saccharomycescerevisiae)，安琪酵母股份有限公司；植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、巴氏醋酸桿菌滬釀1.01(AcetobacterpasteurianusHN 1.01)，東北林業(yè)大學食品微生物實驗室保藏。

1.3 主要儀器

DH6000A型電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津泰斯特儀器有限公司；5030-PVL型高壓滅菌鍋，長春百奧生物儀器有限公司；PB-10型酸度計，德國Sartorius公司；WYT-4型手持糖度計，泉州中友儀器有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1發(fā)酵基質(zhì)的制備

取m(篤斯越橘)∶m(無菌水)=1∶6進行打漿，加入白砂糖調(diào)整發(fā)酵基質(zhì)的初始糖度至15°Bx，加入1 mol/L小蘇打水溶液調(diào)整發(fā)酵基質(zhì)的初始pH值至4.80，經(jīng)巴氏殺菌后備用。

1.4.2菌種比例的確定

設定酵母菌、植物乳桿菌和醋酸菌的菌種比例為1∶2∶1、2∶1∶1、1∶1∶2、1∶1∶1，分別以6%的接種量接入發(fā)酵基質(zhì)中，發(fā)酵60 h后測定發(fā)酵液的pH值、還原糖、蛋白質(zhì)、總酚、黃酮、原花青素、花色苷含量，以及·OH清除率和總抗氧化能力。

1.4.3單因素實驗

1.4.3.1 發(fā)酵時間的確定

按菌種比例酵母菌∶植物乳桿菌∶醋酸菌=1∶2∶1以6%的接種量接入發(fā)酵基質(zhì)，跟蹤發(fā)酵液的pH值、還原糖、蛋白質(zhì)、總酚含量，以及·OH清除率和總抗氧化能力的變化。

1.4.3.2 接種量的確定

以接種量1.5%、3%、6%、9%、12%接入發(fā)酵基質(zhì)，發(fā)酵60 h后測定發(fā)酵液的pH值、還原糖、蛋白質(zhì)、總酚含量，以及·OH清除率和總抗氧化能力。

1.4.3.3 發(fā)酵溫度的確定

分別在28、33、38、43 ℃的培養(yǎng)箱恒溫發(fā)酵，發(fā)酵60 h后測定發(fā)酵液的pH值、還原糖、蛋白質(zhì)、總酚含量，以及·OH清除率和總抗氧化能力。

1.4.3.4 初始糖度的確定

添加白砂糖將發(fā)酵基質(zhì)初始糖度分別調(diào)至9、12、15、18、21 °Bx，發(fā)酵60 h后測定發(fā)酵液的pH值、還原糖、蛋白質(zhì)、總酚含量，以及·OH清除率和總抗氧化能力。

1.4.4測定方法

1.4.4.1 pH值的測定

采用pH計測定。

1.4.4.2 蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍G-250法測定[10]。取1 mL稀釋后的樣品加入5 mL考馬斯亮藍溶液染色，室溫靜置5 min后，以水代替樣品組作為空白，于波長595 nm處測定吸光值，根據(jù)標準曲線計算樣品中蛋白含量。每組樣品平行測定3次取平均值。

1.4.4.3 還原糖含量的測定

采用DNS法測定[11]。將樣品進行適當稀釋，取2 mL稀釋后樣品加入DNS顯色液1.5 mL，混勻后放入沸水浴5 min，取出后迅速冷卻至室溫。用蒸餾水定容到25 mL，搖勻。在520 nm波長下測定吸光值。結(jié)果用葡萄糖當量表示。每組樣品平行測定3次取平均值。

1.4.4.4 總酚含量的測定

采用福林酚法測定[12]。100 μL適當稀釋后的樣品加入試管中，加水7 mL，搖勻，再加0.5 mL福林試劑，充分搖勻，1 min之后，加入質(zhì)量分數(shù)20%的Na2CO3溶液1.5 mL，混勻，最后加入0.9 mL蒸餾水，于25 ℃水浴條件下避光反應 1 h。在765 nm波長下測定吸光值，結(jié)果用沒食子酸當量表示。每份樣品平行測定3次取平均值。

1.4.4.5 黃酮含量的測定

根據(jù)文獻[13]的方法，略有改動。0.5 mL的樣品加入體積分數(shù)30%的乙醇至5 mL，加入質(zhì)量分數(shù)5%的亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻。6 min后加入質(zhì)量分數(shù)10%的硝酸鋁0.3 mL，搖勻靜置6 min后加入1.0 mol/L的氫氧化鈉4 mL，反應15 min后于510 nm波長下測定吸光值，結(jié)果用蘆丁當量值表示。每組樣品平行測定3次取平均值。

1.4.4.6 原花青素含量的測定

采用香草醛—硫酸法[14]測定。精確移取0.5 mL樣品于試管中，依次加入2.5 mL質(zhì)量分數(shù)4%香草醛-甲醇溶液和2.5 mL濃硫酸—甲醇溶液，搖勻，于30 ℃水浴條件下避光反應20 min。用甲醇代替樣品作為空白對照，在500 nm波長下測定反應體系的吸光值，結(jié)果用兒茶素當量值表示。每組樣品平行測定3次取平均值。

1.4.4.7 花色苷含量的測定

采用pH示差法[15]測定。分別移取1 mL樣品于試管中，用pH值1.0、4.5的緩沖溶液定容到10 mL，置于暗處反應達平衡后(pH值1.0為50 min，pH值4.5為80 min)分別在510、700 nm波長下測定吸光值，根據(jù)公式(1)計算花色苷質(zhì)量濃度。每組樣品平行測定3次取平均值。

(1)

式(1)中：ρ，mg/L；A，吸光度，A=(A510 nm,pH 1.0-A700 nm,pH 1.0)-(A510 nm,pH 4.5-A700 nm,pH 4.5)；ε，矢車菊花素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26 900；DF，稀釋因子；M，矢車菊-3-葡萄糖苷的分子量，449.2。

1.4.4.8 ·OH清除率的測定

采用硫代巴比妥酸法(TBARS)測定，實驗方法參照文獻[15]并作適當修改。取0.25 mL稀釋10倍的樣品，以0.25 mL蒸餾水作為空白對照，向樣品中加入0.5 mL PBS緩沖溶液(pH值7.4，100 mmol/L)、0.2 mL 2-脫氧-D-核糖(28 mmol/L)、0.4 mL Fe3+-EDTA (100 μmol/L FeCl3，104 μmol/L Na2EDTA，體積比1∶1)混勻，再加入0.2 mL H2O2(1 mmol/L)和0.2 mL抗壞血酸溶液(1 mmol/L)，在37 ℃條件下反應1 h。立即加入2 mL 28 g/L的三氯乙酸和2 mL 10 g/L的2-硫代巴比妥酸混勻，沸水浴20 min，然后放入冰水浴中終止反應。在室溫下靜置10 min，于532 nm波長下測定各樣品吸光值，并根據(jù)式(2)計算·OH清除率。

·OH清除率=[1-(A1-A2)/A3] ×100%。

(2)

式(2)中：A1，加測定溶液后的吸光度；A2，加測定溶液，不加脫氧核糖溶液反應后的吸光值；A3，未加測定溶液時的吸光度。

1.4.4.9 總抗氧化能力的測定

采用鐵離子還原/抗氧化力測定法(FRAP)[16]。取2.5 mL TPTZ溶液(用40 mmol/L HCl配置成10 mmol/L的TPTZ-HCl溶液)，25 mL醋酸(100 mmol/L，pH值3.6)，2.5 mL FeCl3(20 mmol/L)，充分混勻后配置FRAP工作液。取0.1 mL樣品加入試管中，以100 μL蒸餾水作為空白對照，向各試管中加入4.9 mL FRAP工作液(現(xiàn)用現(xiàn)配)，混勻，在37 ℃水浴反應30 min，593 nm波長下測定吸光值。根據(jù)標準曲線計算出樣品的總抗氧化能力。

1.5 Box-Benhnken中心組合實驗設計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以總酚含量和·OH清除率為響應值，利用Box-Benhnken設計進行響應面分析。Box-Benhnken中心組合實驗設計見表1。

表1 Box-Benhnken中心組合實驗設計因素水平

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有實驗數(shù)據(jù)以x±sd表示，采用SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)處理，Design-Expert 8.0.6進行實驗設計及分析，以p<0.05或p<0.01為統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種比例對不同指標的影響

菌種比例的確定結(jié)果見表2。

從表2的結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，第1組的總酚、黃酮、原花青素、花色苷含量均稍高于其他3組。第1組·OH清除率和總抗氧化能力均顯著高于其他3組(p<0.05)。由于實驗目的是通過發(fā)酵使發(fā)酵液中總酚含量較高，同時抗氧化能力較強，故綜合考慮選擇第1組菌種比例(酵母菌∶植物乳桿菌∶醋酸菌=1∶2∶1)進行發(fā)酵。在混合發(fā)酵中，發(fā)酵前期酒精發(fā)酵占主導，后期乳酸發(fā)酵占主導，醋酸發(fā)酵在酒精發(fā)酵之后，乳酸發(fā)酵是活性成分增加的主要原因，第1組中乳酸菌為優(yōu)勢菌，這是第1組活性物質(zhì)含量高于其他3組的主要原因[17-18]。酵母菌、乳酸菌及醋酸菌本身具有抗氧化能力，果蔬中的抗氧化成分主要有多酚類、類胡蘿卜素、花色苷和生育酚等，酚類化合物大多可以作為還原劑、金屬螯合劑、單線態(tài)氧猝滅劑和氫供體在體系中來發(fā)揮抗氧化功能[19]，活性物質(zhì)含量的增加也是抗氧化能力提高的原因之一，因此第1組的抗氧化能力顯著高于其他3組(p<0.05)。酒精發(fā)酵占主導時會大量利用還原糖，第3組酵母菌所占比例小，優(yōu)勢菌為醋酸菌，因此第3組剩余還原糖含量顯著高于其他3組(p<0.05)。

表2 菌種比例對發(fā)酵的影響

第1組菌種比例為1∶2∶1，第2組菌種比例為2∶1∶1，第3組菌種比例為1∶1∶2，第4組菌種比例為1∶1∶1；同行中不同字母表示數(shù)值間差異性達到顯著水平(p<0.05)。

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1發(fā)酵時間對不同指標的影響

圖中不同字母表示數(shù)值間差異性達到顯著水平(p<0.05)，下同。圖1 發(fā)酵時間對發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of fermentation time on components and antioxidant activities of Vaccinium uliginosum L.

發(fā)酵過程中pH值、蛋白質(zhì)含量、還原糖含量、總酚含量、·OH清除率和總抗氧化能力隨發(fā)酵時間的變化如圖1。

通過計算溫度條件下各水樣的礦物飽和指數(shù)(表3)發(fā)現(xiàn)，方解石、文石、白云石的飽和指數(shù)均大于0，處于過飽和狀態(tài)，而ZGJ04方解石及文石飽和指數(shù)近似于0，接近平衡狀態(tài)，說明碳酸鹽及硅酸鹽類礦物出現(xiàn)有沉淀的現(xiàn)象；石英、玉髓飽和指數(shù)均小于0，ZGQ08玉髓接近飽和狀態(tài)。螢石能否達到平衡狀態(tài)，主要取決于熱水中的電導率，研究區(qū)螢石飽和指數(shù)處于-1.06～0.1之間，極有可能與冷水的混合有關。

如圖1所示，總酚含量、·OH清除率、總抗氧化能力隨發(fā)酵時間呈先升高后降低變化，并在60 h達到最高點；pH值與還原糖含量隨發(fā)酵時間呈下降趨勢；蛋白質(zhì)含量呈波動升高后下降的變化趨勢。由于實驗的目的是通過發(fā)酵使發(fā)酵液中總酚含量較高，同時抗氧化能力較強，發(fā)酵至60 h時發(fā)酵液的總酚含量及抗氧化能力均最高，故綜合考慮選擇60 h作為發(fā)酵時間。發(fā)酵至72 h時總酚含量及抗氧化能力有所下降的主要原因可能是此時活菌數(shù)下降，菌系活力降低，而總酚含量的降低也是抗氧化能力下降的原因之一。

2.2.2接種量對不同指標的影響

接種量單因素實驗結(jié)果如圖2。

如圖2所示，pH值、蛋白質(zhì)含量、還原糖的含量隨接種量的增加基本呈遞減的趨勢，發(fā)酵液中的微生物在不斷的產(chǎn)酸，分解與利用還原糖和蛋白質(zhì)，隨著接種量的加大，程度在加深；與其他接種量比較，總酚含量、·OH清除率、總抗氧化能力均在6%接種量時，表現(xiàn)出較高的活性。當接種量低于6%時發(fā)酵不充分，當接種量高于6%時發(fā)酵液中微生物數(shù)量過多導致底物濃度不足以滿足其生長需求，同時激烈的競爭會導致底物利用不合理，因此總酚含量及抗氧化能力均在接種量為6%時出現(xiàn)最大值。

圖2 接種量對發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of inoculation volume on components and antioxidant activities of Vaccinium uliginosum L.

2.2.3發(fā)酵溫度對不同指標的影響

發(fā)酵溫度單因素實驗結(jié)果如圖3。

如圖3所示，pH值、還原糖含量在38 ℃時最低，與其他溫度相比，發(fā)酵程度較深；蛋白質(zhì)含量并無明顯差異。與其他發(fā)酵溫度比較，總酚含量、·OH清除率、總抗氧化能力均在發(fā)酵溫度38 ℃時，表現(xiàn)出較高的活性。當發(fā)酵溫度低于38 ℃時，對于植物乳桿菌而言，并未達到其發(fā)酵最佳溫度，發(fā)酵不充分，當發(fā)酵溫度高于38 ℃時，過高的發(fā)酵溫度對酵母菌及醋酸菌有一定的抑制作用，因此總酚含量及抗氧化能力均在發(fā)酵溫度為38 ℃時出現(xiàn)最大值。

2.2.4初始糖度對不同指標的影響

如圖4所示，pH值在15°Bx時最低，剩余還原糖含量隨初始糖度的增加呈遞增趨勢，蛋白質(zhì)含量并無明顯差異；與其他初始糖度比較，總酚含量、·OH清除率、總抗氧化能力均在初始糖度15°Bx時，表現(xiàn)出較高的活性。當初始糖度低于15°Bx時，碳源不充足，發(fā)酵不充分；當初始糖度高于15°Bx時，過高的碳源濃度導致發(fā)酵液滲透壓升高抑制微生物生長，導致微生物代謝不充分，因此總酚含量及抗氧化能力均在初始糖度為15°Bx時出現(xiàn)最大值。

圖3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵的影響Fig.3 Effect offermentation temperature on components and antioxidant activities of Vaccinium uliginosum L.

圖4 初始糖度對發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of initial sugar content on components and antioxidant activities of Vaccinium uliginosum L.

2.3 Box-Benhnken中心組合實驗結(jié)果

Box-Benhnken中心組合實驗設計及結(jié)果、方差分析分別見表3、表4。

將實驗數(shù)據(jù)進行擬合，分別得到總酚含量和·OH清除率的模擬方程，見式(3)、式(4)：

Y1=53.26-0.35A-0.55B+0.54C-0.092D-
0.12AB+0.17AC+0.29AD+0.18BC-0.69BD-
0.065CD-1.95A2-0.43B2-2.48C2-1.69D2；

(3)

Y2=83.64+1.79A+0.98B+0.069C+
1.52D-1.15AB+0.16AC-0.93AD-
0.76BC-0.63BD+0.025CD-2.41A2-
2.01B2-1.45C2-2.33D2。

(4)

由表4的方差分析結(jié)果可知，將總酚含量作為響應值，該模型p<0.01，說明該模型極顯著；失擬誤差p>0.05，說明沒有產(chǎn)生失擬現(xiàn)象。R2為0.9598，說明擬合度良好，方程的顯著性及可靠性極高。方程一次項系數(shù)B、C和二次項系數(shù)A2、B2、C2、D2具有極顯著性，方程一次項系數(shù)A和交互性BD具有顯著性。各因素對總酚含量影響的大小順序依次為接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間。接種量和初始糖度交互作用對總酚含量的影響具有顯著性。發(fā)酵時間、接種量、發(fā)酵溫度和初始糖度交互作用對總酚含量影響的響應面分析見圖5。將·OH清除率作為響應值，該模型p<0.01，說明該模型極顯著；失擬誤差p>0.05，說明沒有產(chǎn)生失擬現(xiàn)象。R2為0.928 0，說明擬合度良好，方程的顯著性及可靠性極高。方程一次項系數(shù)A、B、D和二次項系數(shù)A2、B2、C2、D2具有極顯著性，交互項AB具有顯著性。各因素對·OH清除率影響的大小順序依次為發(fā)酵時間、初始糖度、接種量。發(fā)酵時間和接種量交互作用對·OH清除率的影響具有顯著性。發(fā)酵時間、接種量、發(fā)酵溫度和初始糖度交互作用對·OH清除率影響的響應面分析見圖6。

表3 Box-Benhnken中心組合實驗設計及結(jié)果

表中數(shù)據(jù)為3組平行實驗結(jié)果平均值。

2.4 優(yōu)化發(fā)酵工藝條件的確定及驗證

利用Design-Expert.V 8.0.6軟件的optimization功能，得到篤斯越橘混合菌發(fā)酵的優(yōu)化工藝條件：發(fā)酵時間61.45 h，接種量5.93%，發(fā)酵溫度38.44 ℃，初始糖度15.43°Bx；此發(fā)酵條件下發(fā)酵后的篤斯越橘總酚質(zhì)量濃度達53.19 mg/100 mL，·OH清除率達83.95%。為了驗證模型預測理論值的準確性和真實性，同時為了方便實際操作，將優(yōu)化發(fā)酵工藝的條件調(diào)整為發(fā)酵時間62 h，接種量6%，發(fā)酵溫度38.5 ℃，初始糖度15.5°Bx。在此優(yōu)化條件下進行3次平行實驗，得到發(fā)酵液中總酚質(zhì)量濃度達(53.27±0.16)mg/100 mL，·OH清除率達(83.88±0.19)%。結(jié)果與預測值相差甚小，因此，采用響應面法優(yōu)化的篤斯越橘混合菌發(fā)酵工藝條件準確合理，有實際指導意義。

2.5 陽性對照結(jié)果

優(yōu)化后的篤斯越橘發(fā)酵液的·OH清除率陽性對照結(jié)果見表5。

由表5可以看出，優(yōu)化后的稀釋10倍的篤斯越橘發(fā)酵液的·OH清除率顯著高于作為陽性對照的2 mg/mL維生素C溶液(p<0.01)，其抗氧化活性約為2 mg/mL維生素C溶液的5倍。

表4 Box-Benhnken中心組合實驗方差分析

p<0.05為顯著，用“*”表示；p<0.01為極顯著，用“**”表示。

圖5 發(fā)酵時間、接種量、發(fā)酵溫度和初始糖度交互作用對總酚含量的影響Fig.5 Response surface plot of interaction among fermentation time, inoculation volume, fermentation temperature, and initial sugar content on total phenol content

圖6 發(fā)酵時間、接種量、發(fā)酵溫度和初始糖度交互作用對·OH清除率的影響Fig.6 Response surface plot of interaction among fermentation time, inoculation volume, fermentation temperature, and initial sugar content on hydroxyl radical scavenging rate

0.25mL的10%發(fā)酵液0.25mL的2 mg/mL維生素C·OH清除率/%83.88±0.19a16.16±0.14b

同行中不同字母表示數(shù)值間差異性達到顯著水平(p<0.01)。

3 結(jié)論與討論

本實驗以篤斯越橘為原料，選擇果酒酵母、植物乳桿菌和醋酸菌為發(fā)酵菌種對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。得到的優(yōu)化發(fā)酵工藝條件為：酵母菌、植物乳桿菌、醋酸菌菌種比例1∶2∶1，發(fā)酵時間62 h，接種量6%，發(fā)酵溫度38.5 ℃，初始糖度15.5°Bx。優(yōu)化后篤斯越橘發(fā)酵液的總酚質(zhì)量濃度達(53.27±0.16)mg/100 mL，稀釋10倍的篤斯越橘發(fā)酵液對·OH清除率達(83.88±0.19)%，與發(fā)酵前對比分別提高了56.91%和34.34%，其·OH清除率顯著高于陽性對照組(p<0.01)。實驗結(jié)果表明，發(fā)酵前后總酚含量與·OH清除率均顯著提高(p<0.01)，這與其他研究人員研究結(jié)果相一致[20-21]。Kwaw等[20]研究結(jié)果表明乳酸發(fā)酵顯著影響了飲料中總酚、花青素和類黃酮的含量，乳酸菌在發(fā)酵過程中將復合多酚水解成更簡單、更具生物活性的化合物，這是總酚含量增加的主要原因。漿果含有高含量的維生素C和多酚，已知維生素C和多酚在漿果中以糖苷的形式存在，當用糖苷水解酶從漿果中除去葡萄糖時，漿果的抗氧化活性得到改善，且天然化合物的抗氧化活性在真菌、酵母菌或乳酸菌發(fā)酵后增加[21]，這是抗氧化能力顯著提高的主要原因。對比藍莓酵素及樹莓酵素，本實驗所得篤斯越橘混合菌發(fā)酵產(chǎn)品的·OH清除率顯著高于管章瑞等[22]、程勇杰等[23]的研究結(jié)果(p<0.01)。