范夢蝶， 肖群飛， 杜文斌， 王雅欣， 王天澤， 梁晶晶， 謝建春， 孫寶國

(北京工商大學 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心/食品質量與安全北京實驗室/北京市食品風味化學重點實驗室， 北京 100048)

山西老陳醋是我國傳統(tǒng)名醋，采用古法釀造，陳放曬制過程是其釀制工藝中獨特的核心工序，隨著水分蒸發(fā)或結晶析出，一些物質沉淀或發(fā)生化學變化，使得老陳醋更具柔軟酸醇、綿柔味長的特點[1-4]。但由于曬制周期過長，為縮短生產周期，提高產量，深入了解曬制過程風味變化具有重要意義。

山西老陳醋之所以風味獨特，很大原因在于其成分復雜多樣[5-8]。但目前對山西老陳醋風味的研究報道多數(shù)限于揮發(fā)性化合物的氣相色譜-質譜分析(gas chromatography and mass spectrometry, GC-MS)[5]，而沒有采用氣相色譜-嗅聞(aroma extract dilution analysis in gas chromatography-olfactometry，GC-O)針對香氣活性化合物進行解析。而實際上對整體香氣有貢獻的正是醋中的香氣活性化合物，因此老陳醋風味研究的重點在于解析其所含的香氣活性化合物，尤其是關鍵香氣化合物的構成。課題組前期采用溶劑輔助蒸發(fā)(solvent assistant flavor evaporation, SAFE)法處理樣品，發(fā)現(xiàn)曬制后一些有刺激性氣味的物質含量降低或消失，而某些含硫化合物、吡嗪類化合物含量增加[2]。但SAFE法萃取濃縮步驟較多，一些頭香物質可能損失；而頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HP-SPME)具有簡單快速、無溶劑污染、適合萃取頭香物質等優(yōu)勢[9]，被廣泛用于多種醋的風味分析[10-12]。

本文在前期采用SAFE法的研究基礎上，進一步采用HP-SPME/GC-MS及GC-O分析山西老陳醋曬制前后揮發(fā)性風味物質組成，以便更全面了解山西老陳醋曬制過程風味物質的變化，為老陳醋的工藝改進提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

山西老陳醋(曬制前和曬制后)，山西老陳醋集團有限公司；氯化鈉(分析純)、C5～C23正構烷烴(色譜純)、二氯甲烷溶劑(分析純)、無水Na2SO4(分析純)，國藥集團北京化學試劑有限公司；香料標準品(純度均為95%～99%)，百靈威化學技術有限公司。

手動SPME進樣器、75 μm Car/PDMS萃取纖維，美國Supelco公司；7890A-5975C型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀、7890A型氣相色譜儀，美國Agilent公司；聞香器，瑞士Brechbuehler公司；DF-101S型恒溫加熱磁力攪拌水浴鍋，河南予華儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1固相微萃取

固相微萃取纖維在氣相色譜的進樣口于250 ℃老化至無雜峰。取7 g醋樣，置于20 mL萃取瓶中，加入2.5 g氯化鈉，40 ℃水浴中保溫，頂空吸附40 min。做3組平行實驗。

1.2.2GC-MS分析

GC條件：毛細管柱為DB-WAX (30 m×0.25 mm，0.25 μm)。升溫程序為起始柱溫35 ℃，保持2 min；以3 ℃/min升到170 ℃，再以5 ℃/min升到250 ℃。載氣為氦氣，流速1.0 mL/min；萃取纖維250 ℃解析2 min進樣；不分流模式。

MS條件：電子轟擊電離源，能量70eV；四極桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；全掃描模式，質量掃描范圍33～450 amu；輔助加熱線溫度230 ℃。

1.2.3GC-O分析

GC-O系統(tǒng)由Agilent 7890A GC裝置及嗅聞裝置組成。GC裝置配有FID檢測器；毛細管柱為DB-5 (30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序為起始柱溫40 ℃，以5 ℃/min升到250 ℃。進樣口溫度250 ℃；載氣為氮氣(純度為99.999%)，流速1.0 mL/min；不分流模式。

將吸附后的萃取纖維插入氣相色譜進樣口，于250 ℃解吸2 min。加濕后的空氣攜帶柱后流出物進入嗅聞口，通過軟件記錄氣味特征。采用頻率法分析，共3名評價員，每人嗅聞2次。

1.3 定性分析

在相同GC-MS、GC-O條件下進樣C5～C23正構烷烴，按式(1)計算保留指數(shù)(retention indices，RI)。

RI=100×n+ti-tnt(n+1)-tn。

(1)

式(1)中：tn和tn+1分別為碳數(shù)為n、n+1的正構烷烴的保留時間，ti是在tn和tn+1之間的第i個化合物的保留時間。

根據(jù)Nist 14譜庫、嗅聞氣味特征、保留指數(shù)、標準品等鑒定化合物。

2 結果與討論

2.1 2種醋中的揮發(fā)性風味物質鑒定結果

采用GC-MS及GC-O從晾曬前后的山西老陳醋樣品中鑒定出的化合物及含量見表1。2種醋中氣-質聯(lián)機共鑒定出84種揮發(fā)性化合物，包括含硫化合物(2種)、含氮雜環(huán)(14種)、含氧雜環(huán)(13種)、醛類(7種)、酮類(13種)、醇類(6種)、酸類(5種)、酯類(10種)、酚類(11種)、其他類(3種)。

氣相色譜-嗅聞檢測出42個氣味活性區(qū)，共鑒定出42種物質，其中有33種在氣-質聯(lián)機中檢測到。但3-甲硫基丙醛、2-甲氧基-3-仲丁基吡嗪、5-甲基-2-乙酰基呋喃、庚酸、γ-壬內酯、苯乙酸乙酯等，盡管GC-O檢測頻率較高，但由于含量低在氣-質聯(lián)機中卻未檢測到，這可能是由于它們的氣味閾值低。

由表1可知，氣-質聯(lián)機檢測，曬前醋中主要化合物為(按表中數(shù)據(jù)計算，占總面積>1%)：乙酸、糠醛、2,3-丁二酮、乙偶姻、糠醇、對乙基苯酚、苯酚、二苯甲酮、己酸、乙酸乙酯、水楊醛、茴香腦、苯乙酮、四甲基吡嗪、鄰甲氧基苯酚共15種。曬后醋中檢測出的主要化合物為：乙酸、2,3-丁二酮、糠醛、糠醇、四甲基吡嗪、乙偶姻、苯乙醇、丙酸、苯酚、乙酸乙酯、2,3-丁二醇、乙酸苯乙酯、鄰甲氧基苯酚、5-甲基糠醛、茴香腦共15種。其中乙酸、糠醛、2,3-丁二酮、糠醇、四甲基吡嗪等10種化合物為二者共有的含量高的化合物。以上從曬后醋中檢測到的乙酸、四甲“-”，未檢測到。峰面積分析結果為3個樣品的平均值；不同字母標注代表存在顯著性差異(p<0.05)，相同字母代表無顯著性差異；MS，檢索Nist 14質譜庫鑒定；RI，核對保留指數(shù)鑒定；S，標準品鑒定；Odor，嗅聞氣味鑒定。

表1 頂空固相微萃取/氣-質聯(lián)機及氣相色譜-嗅聞從曬前、曬后醋中檢測的揮發(fā)性香氣物質

續(xù)表1

續(xù)表1

基吡嗪、苯乙醇、乙酸乙酯等化合物，苗志偉等[3]在市場購置的山西老陳醋中也曾檢測到。

GC-O檢測結果中，曬前醋中頻率較高(頻率>4)的物質有13種，包括乙酸、3-甲硫基丙醛、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、2-呋喃丙烯醛、γ-壬內酯、香蘭素、3-甲基丁酸、庚酸等。曬后醋中GC-O檢測頻率較高(頻率>4)的物質有12種，包括乙酸、3-甲硫基丙醛、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、2-呋喃丙烯醛、5-甲基-2-乙?；秽?、5-甲基-2-苯基-2-己烯醛、異香蘭素、香蘭素、3-甲基丁酸等。曬前曬后2種醋中共有的檢測頻率較高(頻率>4)的化合物有11種，具有煮土豆、堅果、肉桂、甜巧克力、酸、椰子香等香氣特征。以上這些檢測頻率大的化合物，應對曬前或曬后醋的總體香氣貢獻較大。

2.2 醋曬制前后香氣物質組成變化

由表1可知，曬后含氧雜環(huán)、醇類、酚類化合物的種類數(shù)均有所增加，而含氮雜環(huán)、酮類、酸類、酯類化合物種類數(shù)有所減少。曬后新出現(xiàn)的化合物共14種，其中GC-O檢測有氣味活性為3-甲硫基丙醇、2,5-二甲基-3-異戊基吡嗪、苯甲醇，曬制過程的這些化合物的出現(xiàn)有利于增加陳醋的肉香、烤香、花香等香氣特征。3-甲硫基丙醇，具有肉香，與3-甲硫基丙醛均可來源于微生物發(fā)酵代謝過程[2,13]；3-甲硫基丙醛在不同的發(fā)酵食品中均有被發(fā)現(xiàn)[2]，具有土豆香氣，GC-O檢測出較高頻率，對醋的整體風味貢獻很大。

曬后消失的化合物共19種，它們來源于酒精發(fā)酵或乙酸發(fā)酵階段。如二甲基二硫醚可由蛋氨酸降解產生的甲硫醇進一步轉化產生，是蛋氨酸通過酵母代謝的中間產物[14]；其中檢測到有氣味活性的為二甲基二硫醚、苯丙酮、丁酸、3-甲基戊酸等，具有洋蔥、花香、酸臭、腐臭、干酪等雜味，其在曬制過程中蒸發(fā)逸失時，將使腐臭、干酪雜味消失。

圖1 2種醋中共有化合物曬制前后含量比較Fig.1 Comparison of amounts of major volatile flavor compounds of two kinds of vinegars

2種醋共有化合物曬前曬后含量變化見圖1，其中圖1(a)為醋中主要化合物曬制前后含量變化，圖1(b)為一些曬制前后含量明顯變化的非主要化合物含量變化。由圖1(a)可知，20種主要化合物中，四甲基吡嗪、糠醇、2,3-丁二醇、苯乙醇、丙酸、乙酸苯乙酯6種化合物曬后含量升高；其中四甲基吡嗪、苯乙醇、乙酸苯乙酯3種物質GC-O檢測到氣味活性，對香氣有一定貢獻，因此它們的含量升高會使醋的堅果、花、水果香等香氣增強。尤其四甲基吡嗪(即川芎嗪)，它是醋中的一個重要香氣化合物[8]，具有烤堅果香氣，可由發(fā)酵體系中的乙偶姻和主要由氨基酸轉化而來的氨經過非酶促反應形成。在晾曬時醋中的氨基酸還可發(fā)生美拉德反應產生氨，從而乙偶姻進一步被消耗形成四甲基吡嗪[15]，因此晾曬后四甲基吡嗪含量升高幅度大，由圖1(a)可知含量增加超過1倍。此外，曬制后，苯乙醇、糠醇的相對含量有所增加，可能也與美拉德反應有關。其中苯乙醇可由苯丙氨酸經Strecker降解產生的苯乙醛進一步還原生成[2]。乙酸苯乙酯少量產生于酒精發(fā)酵階段，大量產生于醋酸發(fā)酵階段，由苯乙醇在酯酶的作用下合成[16]。曬制后乙酸苯乙酯的含量增加可能是因醋酸與苯乙醇發(fā)生反應造成?？反嘉礄z測到氣味活性，而苯乙醇、乙酸苯乙酯有氣味活性，雖GC-O檢測頻率不高，對醋的總體香氣也有一定影響。

圖1(a)所示的20種醋中主要化合物中，曬制后，乙酸、糠醛、乙偶姻(3-羥基-2-丁酮)、2,3-丁二酮、5-甲基糠醛、乙酸乙酯、對乙基苯酚等化合物含量減少。其中乙酸、糠醛、乙酸乙酯具有酸、焦糖、水果香氣， GC-O檢測頻率較高，貢獻較大；乙偶姻、苯乙酮、5-甲基糠醛、2,3-丁二酮等化合物也檢測到氣味活性，分別具有酸奶、水果、奶香等香氣特征，因此其含量降低使醋的總體香氣會發(fā)生變化。乙酸、糠醛、2,3-丁二酮3種物質是醋中含量較高的化合物，約占到醋中所有化合物的50%。乙酸是酵母菌利用糖類物質產生乙醇，乙醇又繼續(xù)被醋酸菌分泌的乙醇脫氫酶氧化成乙醛，乙醛再繼續(xù)氧化而形成[17]，其在晾曬過程中揮發(fā)造成減少?？啡┦怯晌炀厶窃谒岬淖饔孟滤馍晌焯?，再由戊糖脫水環(huán)化而成[18]，具有焦糖香氣，糠醛的減少與上述的其還原成糠醇并進一步與乙酸反應形成乙酸糠酯有關；5-甲基糠醛可由己糖脫水環(huán)化而成[18]。2,3-丁二酮主要產生在微生物發(fā)酵階段，可由乳酸和酵母代謝產生[19]，且和3-羥基-2-丁酮可以相互轉化，具有輕微奶香。乙偶姻產生于發(fā)酵階段，可由乳酸被乳酸脫氫后變成丙酮酸，由丙酮酸變?yōu)?-羥基-2-丁酮，具有酸奶味。2,3-丁二酮、乙偶姻(3-羥基-2-丁酮)均為四甲基吡嗪的前體物質，晾曬過程中，隨著四甲基吡嗪的不斷產生而被消耗[20]，因此晾曬后含量降低。乙酸乙酯主要產生于醋酸發(fā)酵中期，由乙酸和乙醇酯化反應生成，具有水果香，曬制過程中乙酸乙酯揮發(fā)跑掉，因此含量降低。

如圖1(b)所示，2種醋共有的非主要化合物(按表中數(shù)據(jù)計算，占總面積<1%)中，有21種曬制前后含量變化較大，其中含量升高的有5種，降低的有16種。2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、5-甲基-2-乙酰基呋喃、2-呋喃丙烯醛、5-甲基-2-苯基-2-己烯醛、3-甲基丁酸、苯乙酸乙酯、香蘭素7種化合物，雖然含量較低，但GC-O檢測頻率較高，它們的變化對曬后醋的香氣影響較大。2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、5-甲基-2-乙酰基呋喃含量的升高，將使曬后醋的堅果香、焦糖香增強。其他化合物含量的降低，將減弱醋的肉桂香、青香、腐臭、干酪、酯香、香甜巧克力香，從而使曬后醋的雜味減少，整體香氣更和諧。2-呋喃基丙烯醛可由糠醛和乙醛縮合而成，具有肉桂香。5-甲基-2-苯基-2-己烯醛，可由苯乙醛與丁醛縮合形成，苯乙醛在醋酸發(fā)酵階段通過苯丙氨酸的Strecker降解形成[11，21]，其含量降低與上述的苯乙醛還原成苯乙醇有關。丁醛可能來源于脂肪酸的氧化降解[22]。3-甲基丁酸是以支鏈氨基酸亮氨酸為前體經微生物降解產生。香蘭素、愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚可能由所用高粱、麥麩等原料帶入，具有較高的GC-O檢測頻率，有香甜巧克力、辛香、藥香味，曬后仍有一定含量存在。此外，產生于醋酸發(fā)酵階段的琥珀酸二乙酯等酯類化合物，也由于曬制過程的分解和蒸發(fā)，導致含量減少，并GC-O不再檢測到，因此其存在對曬后醋的氣味影響較小。

3 結 論

HP-SPME/GC-MS及GC-O分析山西老陳醋曬制前后的揮發(fā)性風味物質組成，表明2種醋總體香氣特征類似。但與曬前相比，曬后19種化合物香氣活性成分消失，14種香氣活性成分新出現(xiàn)。具有焦糖香、水果香、花香的四甲基吡嗪、乙酸苯乙酯、苯乙醇等主要物質含量有較大的增加；多數(shù)非主要成分如2-呋喃丙烯醛、5-甲基-2-苯基-2-己烯醛、3-甲基丁酸、3-甲基惡唑等含量減少，從而肉桂香、青香、腐臭、干酪、壤香等雜味消失。由于香氣物質之間的相對比例發(fā)生變化，總體香氣趨于和諧、醇厚，形成其特有的酸、綿、香、甜的香氣特征。這與先前采用SAFE樣品處理方法所觀察的現(xiàn)象基本一致。后續(xù)還將對主要香氣物質進行準確定量，精確地了解曬制后老陳醋主要風味物質的含量變化及相對比例關系變化，以便從分子化學角度去研究美拉德反應、酯化反應、水解反應、縮合反應等物理化學反應及曬制期間，光照、溫度、空氣等對老陳醋風味形成的影響，為縮短老陳醋的曬制周期，提高老陳醋的產量提供技術指導。