王 赫，王 斌，張騰霄 李 華，于春賀

(綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江綏化 152061)

菊苣又名苦苣，菊科多年生藥食兩用植物，主要含有多糖類、萜類、黃酮類等化學(xué)成分，具有清肝利膽、健胃消食、利尿消腫等功效，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗腫瘤等生物活性[1]。葛根為豆科植物葛的根，屬藥食兩用植物，主要活性成分為異黃酮類化合物，臨床上用于治療冠心病、心絞痛、眼底病、突發(fā)性耳聾、偏頭痛、頸椎病等疾病[2]。金銀花為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，它是我國(guó)第一批藥食兼用植物，具有抗病原微生物、抗炎、解熱、保肝、抗生育、止血、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、中樞興奮等藥理作用[3]。蒲公英具有清熱、解毒、利尿、散結(jié)等功效，是集營(yíng)養(yǎng)與藥用于一身的寶貴野生資源[4]。本實(shí)驗(yàn)研究菊苣、蒲公英、葛根、金銀花4種藥食同源的藥物配伍后其黃酮類成分的變化規(guī)律，為開(kāi)發(fā)上述4種藥物的保健品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)樣品

樣品編號(hào)及來(lái)源見(jiàn)附表。

1.2 儀器

101-2A型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司；FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；分析天平FA2014，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-50B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司。

附表 樣品編號(hào)及來(lái)源

注：采購(gòu)時(shí)間2016年

1.3 試劑

蘆丁對(duì)照品，中國(guó)食品藥品鑒定研究院；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、蒸餾水，均為分析純。

2 方法

2.1 線性關(guān)系考察

精密稱取干燥恒重蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，65%乙醇溶解，制成1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液，備用。精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、 0.6 mL至25 mL容量瓶中，加入0.7 mL 5% NaNO2，5 min后加入0.7 mL 10% Al(NO3)3，放置10 min，加入5.0 mL 4%的NaOH，混勻后用30%乙醇定容至刻度，38℃水浴中顯色15 min，試劑空白為對(duì)照，510 nm處測(cè)定吸光度[5]。

2.2 樣品測(cè)定

2.2.1樣品液制備 樣品55℃干燥4h，粉碎，過(guò)40目篩。精密稱取樣品粉末各2.0 g，置100 mL三角瓶中，加70%乙醇30 mL，密封，浸泡6 h，超聲提取15 min，取上清液。提取2次，合并兩次濾液，70%乙醇定容至50 mL，備用。精密稱取1、2、3、4號(hào)樣品粉末各1.0 g，兩兩混勻后按上述提取過(guò)程操作，提取液用70%乙醇定容至50 mL，備用。精密稱取1、2、3、4號(hào)樣品粉末各0.5 g，混勻后按上述提取過(guò)程操作，提取液用70%乙醇定容至50 mL，備用。所有試驗(yàn)平行3次。

2.2.2樣品測(cè)定 按2.1項(xiàng)條件測(cè)定樣品，計(jì)算黃酮含量。計(jì)算公式如式(1)：

百分含量(%)={[(X×V樣÷V取)÷ 1000]÷M}×100

(1)

式(1)中，X為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算為蘆丁的質(zhì)量，單位mg；V取為測(cè)定樣品時(shí)取樣體積；V樣為制備樣品時(shí)總體積；M為制備樣品液時(shí)稱取樣品重量，單位g。

2.3 方法學(xué)考察

按要求進(jìn)行了精密度實(shí)驗(yàn)、加樣回收率實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)等方法學(xué)考察。

3 結(jié)果與分析

3.1 精密度及加樣回收率

精密度及加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，精密度良好，RSD為1.87%，加樣回收率為101.19%。由此可知，亞硝酸鈉—硝酸鋁比色法測(cè)定黃酮含量，方法簡(jiǎn)便、可靠、易行。

3.2 重復(fù)性及穩(wěn)定性

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表明重復(fù)性良好，RSD為1.31%。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，在60 min內(nèi)，吸光度均基本穩(wěn)定。說(shuō)明該方法重復(fù)性好且測(cè)定數(shù)據(jù)穩(wěn)定。

3.3 樣品中黃酮含量

經(jīng)回歸分析，測(cè)定黃酮含量回歸方程為y=1.255x+0.026 2，R2=0.9981，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

由圖2可知，菊苣、葛根、金銀花、蒲公英中的黃酮含量分別為0.75%、2.50%、15.04%、1.22%，其中，金銀花中黃酮含量最高，菊苣中黃酮含量最低。為了解4種樣品配伍后黃酮含量的變化，試驗(yàn)采用兩兩樣品按質(zhì)量比1∶1相互配伍及4種樣品按質(zhì)量比1∶1∶1∶1進(jìn)行配伍后測(cè)定其黃酮含量。同時(shí)，根據(jù)各樣品中測(cè)得的黃酮含量，理論推算出配伍后黃酮含量，與實(shí)際測(cè)量值進(jìn)行比較分析。由圖3可知，金銀花與葛根配伍后黃酮含量最高，為6.85%，菊苣與蒲公英配伍后黃酮含量最低，為0.87%，4種樣品配伍后黃酮含量為3.33%。

圖1 測(cè)定黃酮含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 樣品配伍前各自黃酮含量

圖3 樣品配伍后黃酮含量實(shí)測(cè)值與理論值比較

通過(guò)對(duì)配伍后黃酮實(shí)測(cè)值與理論值比較分析，除了葛根與菊苣、葛根與蒲公英配伍后黃酮實(shí)測(cè)值略高于理論值外，其他配伍組合黃酮實(shí)測(cè)值均都低于理論值，其中，金銀花與蒲公英黃酮實(shí)測(cè)值與理論值相差最為懸殊，相差5個(gè)百分點(diǎn)。葛根與菊苣、葛根與蒲公英配伍后黃酮含量略有上升，有可能是葛根中含有某些成分可提高黃酮的溶出度或它是黃酮化合物生物合成的影響因子，進(jìn)而增加了黃酮類化合物的生物合成。下一步應(yīng)從分子生物學(xué)角度進(jìn)一步研究葛根影響配伍后樣品中黃酮化合物含量變化的作用機(jī)制，進(jìn)而增加配伍后樣品中的黃酮含量。

其他配伍組合黃酮實(shí)測(cè)值均都低于理論值，即配伍后黃酮含量下降，說(shuō)明配伍后黃酮溶出量減少，分析原因可能是樣品中的某些成分易與黃酮成分發(fā)生反應(yīng)或存在某種可降低黃酮含量的成分，從而造成配伍后含量降低。黃酮類化合物分子中多具有酚羥基，易發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)和氧化反應(yīng)，如金銀花中含大量木犀草素，它是一種典型的含4個(gè)酚羥基的黃酮化合物，在提取液中更容易受金屬離子干擾而發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，推測(cè)這是造成樣品配伍后黃酮含量實(shí)測(cè)值顯著低于理論值的原因之一。

4 結(jié)論

本文采用亞硝酸鈉—硝酸鋁比色法測(cè)定黃酮含量，回收率實(shí)驗(yàn)和精密度實(shí)驗(yàn)表明，2種方法均排除了干擾因素，精密度良好，說(shuō)明方法簡(jiǎn)便、可靠、易行?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃酮類化合物在抗老化、調(diào)血脂、降血壓、抗心絞痛等方面療效顯著，對(duì)于開(kāi)發(fā)菊苣、葛根、金銀花、蒲公英以黃酮化合物為主要指標(biāo)的產(chǎn)品，應(yīng)根據(jù)上述配伍規(guī)律合理進(jìn)行配伍，盡量提高配伍后黃酮含量。本實(shí)驗(yàn)僅研究了不同樣品配伍后合在一起提取后的黃酮變化，沒(méi)有研究各樣品先進(jìn)行提取，然后將提取液進(jìn)行配伍后研究黃酮的變化。樣品配伍后化學(xué)成分含量不是簡(jiǎn)單的相加減，更需要注重對(duì)其不同化學(xué)成分組合、量化和相互作用的研究，尤其應(yīng)注重對(duì)綜合效應(yīng)的有效物質(zhì)組群研究[6]。下一步需要研究和完善不同樣品配伍后其他化學(xué)成分的變化，按影響因素、因素水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，確定4種樣品的最佳配伍工藝，為開(kāi)發(fā)上述樣品的保健品提供更為準(zhǔn)確的技術(shù)參數(shù)?！?/p>