曹振杰

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院小兒外科，河南 鄭州 450052)

神經(jīng)母細(xì)胞瘤是一種兒童顱外腫瘤疾病，5歲以下的嬰幼兒是其主要發(fā)病人群，抗腫瘤治療藥物的選擇對(duì)患兒預(yù)后恢復(fù)及生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要[1]。作為常用化療藥物多柔比星可有效殺傷腫瘤細(xì)胞，但長(zhǎng)期應(yīng)用患兒耐受性差，對(duì)正常組織的不良反應(yīng)亦比較大，因此成為臨床抗腫瘤治療難以克服的瓶頸[2]。蛋氨酸腦啡肽(methionine enkephalin，Met-ENK)屬于阿片類生長(zhǎng)因子，除具有免疫調(diào)控及鎮(zhèn)痛作用外，還可顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，在多種腫瘤體外細(xì)胞試驗(yàn)中具有顯著的抗腫瘤作用[3]。Tau蛋白是重要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)蛋白，通過磷酸化進(jìn)行蛋白功能的調(diào)節(jié)，有研究[4]顯示，Tau蛋白磷酸化可加速神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。本研究主要探討多柔比星聯(lián)合Met-ENK對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，以及對(duì)Tau蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)、分組及藥物干預(yù)神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞由中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院饋贈(zèng)。SH-SY5Y細(xì)胞以含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清及青、鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。將密度為5.0×104·mL-1的SH-SY5Y細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，陽性對(duì)照組SH-SY5Y細(xì)胞以1.25 mg·L-1的多柔比星處理，低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組SH-SY5Y細(xì)胞分別以1.25 mg·L-1的多柔比星+10-7、10-5、10-3mol·mL-1Met-ENK處理，陰性對(duì)照組細(xì)胞以等量生理鹽水處理，各組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。

1.2MTT法[4]檢測(cè)各組SH-SY5Y細(xì)胞增殖情況干預(yù)0、24、48、72 h后，各孔加20 μL 5 mg·mL-1MTT溶液，37 ℃孵育4 h，加150 μL二甲基亞砜(DMSO)，采用SpectraMax?M3多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm下吸光光度值OD490 nm，計(jì)算細(xì)胞存活率=陽性對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組OD490 nm/陰性對(duì)照組OD490 nm×100%。

1.3流式細(xì)胞術(shù)[5]檢測(cè)各組SH-SY5Y細(xì)胞周期及凋亡情況細(xì)胞分組及處理同1.1，干預(yù)48 h后收集各組細(xì)胞，1 000 r·min-1離心10 min，加500 μL緩沖液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2.0×105/孔，加5 μL Annexin V-FITC避光孵育5 min，加5 μL碘化丙啶(PI)避光孵育5 min，1 h內(nèi)以FACSCalibur型流式細(xì)胞儀檢測(cè)并記錄各組SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4Hoeschest33258細(xì)胞核染色[5-6]檢測(cè)各組SH-SY5Y細(xì)胞凋亡情況細(xì)胞分組及處理同1.1，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)基，經(jīng)預(yù)冷多聚甲醛固定15 min，然后加Hoeschest 33258工作液避光孵育15 min，以抗熒光淬滅劑封片，于Leica DMi8-M熒光顯微鏡下觀察陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組和高劑量實(shí)驗(yàn)組SH-SY5Y細(xì)胞核染色情況。

1.5WesternBlot法[7]檢測(cè)各組SH-SY5Y細(xì)胞磷酸化Tau(p-Tau)蛋白表達(dá)情況細(xì)胞分組及處理同1.1，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，測(cè)定總蛋白濃度，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、染色等，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，以Image J軟件分析各組SH-SY5Y細(xì)胞p-Tau蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1各組SH-SY5Y細(xì)胞增殖情況與陰性對(duì)照組比較，干預(yù)24、48、72 h后，陽性對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率明顯降低，且各實(shí)驗(yàn)組低于陽性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活率隨Met-ENK濃度的增大逐漸降低(P<0.05)。見圖1。

2.2各組SH-SY5Y細(xì)胞周期分布及凋亡與陰性對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組凋亡率、G0/G1期細(xì)胞比例顯著升高，且中、高劑量實(shí)驗(yàn)組高于陽性對(duì)照組(P<0.05)，隨Met-ENK作用濃度增加實(shí)驗(yàn)組凋亡率、G0/G1期細(xì)胞比例呈逐漸升高趨勢(shì)(P<0.05)；與陰性對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組S期細(xì)胞比例顯著降低，且中、高劑量實(shí)驗(yàn)組低于陽性對(duì)照組(P<0.05)，隨Met-ENK作用濃度增加實(shí)驗(yàn)組S期細(xì)胞比例呈逐漸降低趨勢(shì)(P<0.05)；而陽性對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組G2/M期細(xì)胞比例變化不顯著(P>0.05)。見表1。

表1 各組SH-SY5Y細(xì)胞周期分布及凋亡 %

注：與陰性對(duì)照組比較，1)P<0.05；與陽性對(duì)照組比較，2)P<0.05

2.3各組SH-SY5Y細(xì)胞凋亡情況Hoeschest 33258細(xì)胞核染色顯示，陰性對(duì)照組SH-SY5Y細(xì)胞核藍(lán)色熒光染色分布均勻；而陽性對(duì)照組和高劑量實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞濃縮致密，顆粒狀凋亡細(xì)胞核數(shù)量較對(duì)照組明顯增多，細(xì)胞核聚集、斷裂成塊。見圖2。

圖2 各組SH-SY5Y細(xì)胞凋亡情況(×200)

2.4各組SH-SY5Y細(xì)胞p-Tau蛋白表達(dá)情況陰性對(duì)照組，陽性對(duì)照組，低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞p-Tau蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.89±0.11、0.95±0.16、1.11±0.31、1.21±0.29、1.52±0.33，與陰性對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組和低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞p-Tau蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高，中、高劑量實(shí)驗(yàn)組高于陽性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞p-Tau蛋白相對(duì)表達(dá)量隨著Met-ENK濃度的增大逐漸升高(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組SH-SY5Y細(xì)胞p-Tau蛋白表達(dá)情況

注：A：陰性對(duì)照組；B：陽性對(duì)照組；C：低劑量實(shí)驗(yàn)組；D：中劑量實(shí)驗(yàn)組；E：高劑量實(shí)驗(yàn)組

3 討論

隨著人類生活方式的轉(zhuǎn)變及生活壓力的增大，惡性腫瘤的發(fā)生率不斷升高，成為嚴(yán)重威脅人類生命健康安全的事件之一，因此抗腫瘤藥物的研究成為臨床迫在眉睫的重要任務(wù)。Met-ENK是由5種氨基酸組成的天然肽類化合物，可特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面上的受體，并發(fā)揮抑制腫瘤惡性增殖的作用，同時(shí)其還具有傳統(tǒng)阿片生長(zhǎng)因子所具有的免疫調(diào)控、鎮(zhèn)痛等藥理作用。Abate等[5]研究表明，Met-ENK對(duì)移植腫瘤細(xì)胞的裸鼠具有較好抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，同時(shí)可延長(zhǎng)荷瘤動(dòng)物的生存時(shí)間。楊崢維等[6]研究顯示，Met-ENK可抑制包括肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、口腔癌、乳腺癌等在內(nèi)的8種惡性腫瘤細(xì)胞的體外增殖，但其抑制強(qiáng)度不同，且與藥物作用時(shí)間相關(guān)。

本研究中采用MTT法檢測(cè)各組SH-SY5Y細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，干預(yù)24、48、72 h后，陽性對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率明顯降低，且各實(shí)驗(yàn)組低于陽性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率隨著Met-ENK濃度的增大逐漸降低，表明Met-ENK聯(lián)合多柔比星可更有效地抑制SH-SY5Y細(xì)胞的增殖，降低細(xì)胞存活率，且具有Met-ENK劑量依賴性。李彥博等[7]研究表明，Met-ENK可將腫瘤細(xì)胞周期抑制于G0/G1期，其是通過上調(diào)抑癌基因P53、P16和細(xì)胞周期蛋白激酶相關(guān)的抑制因子P21表達(dá)，下調(diào)磷酸Rb蛋白表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。本研究結(jié)果中，陽性對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組凋亡率、G0/G1期細(xì)胞比例較陰性對(duì)照組升高，S期細(xì)胞比例降低，同時(shí)說明Met-ENK聯(lián)合多柔比星可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，并將細(xì)胞阻止于G0/G1期；Hoeschest 33258細(xì)胞核染色也同樣顯示，陽性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡現(xiàn)象較陰性對(duì)照組更為突出。Tau蛋白主要在神經(jīng)細(xì)胞中廣泛表達(dá)，屬于微管蛋白家族成員之一，可被磷酸化、乙酰化、氧化、糖基化等修飾，其中過度磷酸化可使Tau蛋白在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)堆積，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡[8-9]。本研究結(jié)果中，與對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組和低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞p-Tau蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高，中、高劑量實(shí)驗(yàn)組低于陽性對(duì)照組，且具有一定的劑量依賴性。這表明Met-ENK可能是通過加速Tau的磷酸化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而起到較好的抗腫瘤作用。

綜上所述，多柔比星聯(lián)合Met-ENK可抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞的生長(zhǎng)，并促進(jìn)其凋亡，這可能與降低Tau蛋白磷酸化水平有關(guān)，但關(guān)于Met-ENK的抗腫瘤作用機(jī)制還可能存在其他的途徑，這需要臨床進(jìn)一步研究加以確認(rèn)。