（河北醫(yī)科大學法醫(yī)學院 河北省法醫(yī)學重點實驗室，河北 石家莊 050017）

血栓致死的法醫(yī)學案件中血栓形成時間是法醫(yī)病理學研究和亟待解決的難點和重點。創(chuàng)傷等外部事件發(fā)生肺栓塞死亡的案例中，法醫(yī)檢案時面臨的關(guān)鍵問題是判斷此次創(chuàng)傷與肺栓塞是否存在因果關(guān)系，肺內(nèi)血栓如何形成、何時形成及其來源，血栓形成是否與創(chuàng)傷存在時間上的先后[1-2]等。在原發(fā)性和（或）繼發(fā)性危險因素作用下血液纖溶和凝血系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)失衡，血液在體內(nèi)異常凝結(jié)形成血栓。因各種原因血栓可由其原始形成部位脫落，隨血液循環(huán)到肺形成肺栓塞。血栓的形成轉(zhuǎn)歸過程為血栓形成、血栓機化和再通。血栓的形成是一個動態(tài)的過程，但針對血栓動態(tài)形成的時間特異性指標還未闡明。血栓形成時序性變化規(guī)律對于揭示血栓形成特定時間變化具有重要意義，這對于解決涉及創(chuàng)傷、疾病等復雜肺栓塞法醫(yī)學案例的血栓形成時間、來源等問題具有指導意義。

本研究通過建立大鼠下腔靜脈血栓動物模型，采用特殊染色觀察血栓形成不同時期組織結(jié)構(gòu)變化特點，并通過免疫組織化學技術(shù)觀察CD61、α-SMA和CD34的表達變化，研究血栓形成不同時期特異性變化指標，以期為血栓形成致死性法醫(yī)學案件的血栓形成時間鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康成年雄性SD大鼠80只（河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供），體質(zhì)量（250±10）g，隨機分為 10 組：建模術(shù)后 0 h、3 h、6 h、12 h、1 d、3 d、1 周、2 周、3 周和4周組。每組8只大鼠。

1.2 主要試劑和儀器

兔來源CD61、CD34抗體［艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司］，兔來源α-SMA抗體（美國Affinity Biosciences公司），生物素化二抗工作液SP-9000（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；BX61型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 動物模型的建立

依據(jù)文獻[3]，經(jīng)大鼠腹部正中切口入腹，逐層切開至腹腔，切口長度約2cm（下至凝固腺上葉上緣，上至露出肝組織一角），將小腸撥向腹部兩側(cè)充分顯露下腔靜脈。打開后腹膜，充分游離下腔靜脈及其各屬支，用1#縫合線結(jié)扎左腎靜脈水平以下下腔靜脈各靜脈屬支。確認左腎靜脈下2～3mm處為下腔靜脈結(jié)扎點，結(jié)扎點下穿過一條4#縫合線，另沿下腔靜脈走行方向并行放置一條4#縫合線。結(jié)扎縫合線至稍有阻力且恰能抽出并行放置的4#縫合線，謹慎抽出并行的4#縫合線。完成深靜脈血栓“狹窄法”模型。依據(jù)下腔靜脈側(cè)支循環(huán)形成，確定觀察血栓形成最長時間分組。

1.4 樣品制備

建模術(shù)后分別依據(jù)各時間分組取材。取材時以10%水合氯醛溶液（0.5mL/kg）腹腔麻醉大鼠，自結(jié)扎點起取長度1 cm下腔靜脈段，取材后以10%中性甲醛溶液固定12h，脫水、透明、浸蠟、包埋，4℃保存?zhèn)溆?。采用石蠟切片機將術(shù)后各組分別切片后行HE染色、Perls染色、Von Kossa染色和鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）免疫組織化學染色。

1.5 結(jié)果分析

1.5.1 觀察指標

HE染色觀察血栓形成、機化和再通的大致過程；Perls染色和Von Kossa染色分別觀察各組含鐵血黃素析出及鈣鹽沉積情況；SP免疫組織化學染色觀察CD61、α-SMA、CD34表達情況，其抗體濃度分別為1∶300、1∶400、1∶4000。

顯微鏡圖像采集后，運用Image-Pro Plus 6.0軟件分別計算各組切片含鐵血黃素（Perls染色中呈藍色）、鈣鹽沉積（Von Kossa 染色中呈黑色）、CD61（血栓組織呈棕黃色）陽性表達部位的累積光密度（integrated optical density，IOD）值。顯微鏡下每組切片選取10個隨機視野，運用Image-Pro Plus 6.0軟件計算α-SMA陽性細胞個數(shù)。顯微鏡Olympus cellSens Dimension軟件計算新生血管腔面積（CD34陽性表達）與原有血管腔面積百分比。

1.5.2 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 血栓形成、機化和再通

術(shù)后0h未見血栓形成（圖1A）；術(shù)后3h微量血小板血栓形成（圖1B）；術(shù)后6h血管壁邊緣少許白色血栓形成（圖1C）；術(shù)后12h片狀血小板小梁形成；術(shù)后1d大量血小板小梁形成（圖1D）；術(shù)后3d血栓增生樣改變（圖1E）；術(shù)后4周血栓組織機化，血管部分再通（圖1F）。

2.2 Perls染色、Von Kossa染色

2.2.1 Perls染色

Perls染色可將含鐵血黃素顆粒染成藍色，其他組織染成紅色。由圖2可見：建模術(shù)后0h～1d未見含鐵血黃素顆粒；含鐵血黃素顆粒最早見于術(shù)后3d，散落于血栓內(nèi)部；術(shù)后3d～4周含鐵血黃素顆粒呈增多趨勢，至術(shù)后4周機化的血栓組織中釋放出大量含鐵血黃素顆粒。Perls染色觀測血栓中含鐵血黃素顆粒的IOD值結(jié)果見表1。

圖1 血栓形成、機化和再通（HE×100）

圖2 含鐵血黃素顆粒（Perls×100）

表1 Perls染色觀測血栓中含鐵血黃素顆粒（n=8，±s）

表1 Perls染色觀測血栓中含鐵血黃素顆粒（n=8，±s）

注：1）與相鄰上組比較，P＜0.05

組別 IOD 1d 0 3d 514.23±168.65 1 周 945.16±29.331）2 周 1200.37±223.971）3 周 1620.59±520.031）4 周 2980.67±2080.981）

2.2.2 Von Kossa染色

Von Kossa染色可將鈣鹽沉積染成黑色，其他組織呈紅色。建模術(shù)后0h～3d未見鈣鹽沉積，術(shù)后1周血栓內(nèi)見散在鈣鹽沉積。隨建模時間的延長，鈣鹽沉積增多，包含大量鈣鹽的異物巨噬細胞體積增大、數(shù)量增多，未經(jīng)吸收的鈣鹽直接存在于血栓組織中形成血栓鈣化，最終形成靜脈石（圖3）。Von Kossa染色觀測血栓中鈣鹽沉積顆粒的IOD值結(jié)果見表2。

圖3 鈣鹽沉積（Von Kossa×100）

表2 Von Kossa染色觀測血栓中鈣鹽沉積顆粒（n=8，±s）

表2 Von Kossa染色觀測血栓中鈣鹽沉積顆粒（n=8，±s）

注：1）與相鄰上組比較，P＜0.05

組別 I O D 3 d 0 1 周 1 7 8 1.7 0±1 6 8.8 0 2 周 1 9 4 2.1 7±3 5 9.3 9 3 周 3 4 4 6.8 3±9 0 5.3 4 1）4 周 4 9 9 8.2 5±7 0 0.9 0 1）

2.3 免疫組織化學染色

CD61最早于術(shù)后3h在血栓內(nèi)部散在表達（圖4A）；術(shù)后3～6h差異無統(tǒng)計學意義；術(shù)后1d達到峰值（圖4B）；隨后開始下降，至術(shù)后2周CD61表達最低（圖4C）；隨后在機化的血栓與管腔形成的二次狹窄部位新形成的血小板血栓內(nèi)重新表達（圖4D），但低于其峰值。各組免疫組織化學染色觀察血栓中CD61的表達見表3。

圖4 CD61 的表達（SP×100）

表3 免疫組織化學染色觀察血栓中CD61的表達（n=8，±s）

表3 免疫組織化學染色觀察血栓中CD61的表達（n=8，±s）

注：1）與相鄰上組比較，P＜0.05；2）與 1d 組比較，P＜0.05

組別 I O D 0 h 1 5 6.3 5±7 5.4 6 3 h 3 7 1 2.6 2±2 5 1 3.0 9 1）6 h 3 8 7 1.8 9±1 3 8 8.4 2 1 2 h 5 0 9 0.4 0±7 2 6.5 5 1）1 d 6 9 9 8.2 8±2 4 6 9.7 3 1）3 d 3 9 7 4.5 1±2 2 7 2.0 4 1）1 周 3 6 9 2.0 6±3 8 1.2 4 2 周 2 4 7 4.3 3±1 4 4 4.4 6 1）3 周 4 6 2 5.6 1±1 5 7 7.3 2 1）4 周 6 1 0 9.3 4±8 6 9.5 4 1）2）

由圖5可見：α-SMA的陽性表達最早見于術(shù)后3d的血栓組織邊緣，術(shù)后1周表達達到高峰。各組免疫組織化學染色觀察血栓中α-SMA的表達見表4。

CD34最初少量表達于術(shù)后3d靠近管壁的血栓部位的新生內(nèi)皮細胞內(nèi)（圖6B）；術(shù)后1周開始有相對較大的新生血管形成，CD34表達面積（新生血管腔面積）約占原有血管腔面積的7.46%，該新生血管通常位于與管壁緊密連接的血栓外部，但內(nèi)部亦可見（圖6C）；術(shù)后2～4周，新生血管融合成較大管腔的血管，術(shù)后4周CD34表達面積可達原有血管腔面積的21.61%，其內(nèi)有新鮮血液流動（圖6D～F）。各組免疫組織化學染色觀察血栓中CD34的表達（新生血管腔面積）見表5。

圖5 α-SMA 的表達（SP×100）

圖6 CD34 的表達（SP×100）

表4 免疫組織化學染色觀察血栓中α-SMA的表達（n=8，±s）

表4 免疫組織化學染色觀察血栓中α-SMA的表達（n=8，±s）

注：1）與相鄰上組比較，P＜0.05

組別 陽性細胞數(shù)1d 0 3d 44.86±15.27 1 周 75.40±35.471）2 周 57.22±16.391）3 周 43.40±16.401）4 周 65.75±14.801）

表5 免疫組織化學染色觀察血栓中CD34的表達（n=8，±s，%）

表5 免疫組織化學染色觀察血栓中CD34的表達（n=8，±s，%）

注：1）與相鄰上組比較，P＜0.05

組別 新生血管腔面積1d 0 3d 0.44±0.05 1 周 7.46±6.081）2 周 17.73±7.371）3 周 19.74±6.471）4 周 21.61±4.351）

3 討 論

血栓形成是一個動態(tài)過程，常有血小板、纖維蛋白、紅細胞、血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞等多種成分參與，這些成分通過影響血液纖溶和凝血系統(tǒng)引起血栓。血小板黏附于受損血管內(nèi)膜是血栓形成的初始步驟，CD61抗原為整合素的β3鏈，CD41抗原為整合素的 αⅡb 鏈，兩者共同形成 CD41/CD61（GPⅡb/Ⅲa）復合物，該復合物在細胞聚集方面發(fā)揮重要作用，其與纖維蛋白原等的結(jié)合是血小板凝集過程的最后途徑[4]。血小板凝集在血管內(nèi)膜，形成混合血栓的頭部。本研究通過免疫組織化學法檢測CD61含量的變化，在術(shù)后3h即可見陽性表達，術(shù)后1d達到高峰，可見廣泛的血小板小梁形成，而后表達有所下降，至術(shù)后4周血栓與管腔形成的二次狹窄腔隙內(nèi)新生的白色血栓部位CD61重新表達，但表達量均低于其峰值。

在血栓形成的過程中，成纖維細胞的出現(xiàn)與血栓內(nèi)膠原的形成通常相互并行[5]。成纖維細胞是一種多形性細胞，當成纖維細胞合成膠原時，呈典型的星狀或紡錘狀外觀。且成纖維細胞尚參與體內(nèi)多種器官纖維化的過程，當在身體任何部位造成創(chuàng)面時，早期主要是多形核粒細胞，然后逐漸出現(xiàn)淋巴細胞，直到第3天才出現(xiàn)成纖維細胞，然后迅速增多。成纖維細胞具有分化為平滑肌的能力[6]，本研究選取的平滑肌動蛋白特異性抗體α-SMA最早可見于術(shù)后3d，這與成纖維細胞出現(xiàn)的時間相一致。

含鐵血黃素是由于組織內(nèi)發(fā)生出血、長期慢性淤血及其他病變時，紅細胞釋放出血紅蛋白分解破壞的產(chǎn)物，或者說是紅細胞釋放出的血紅蛋白被巨噬細胞吞噬后，經(jīng)溶酶體降解為含鐵血黃素[7]。資料[8]表明，含鐵血黃素在血紅蛋白釋出后2～3d開始形成，含鐵血黃素可見于組織局部存在陳舊性出血灶、梗死灶內(nèi)的各種出血性病變內(nèi)。本研究發(fā)現(xiàn)，含鐵血黃素最早見于血栓形成第3天，通常在血栓形成的1周后或更長時間檢出量增加，這對于創(chuàng)傷時間推斷可提供有效佐證。

新近形成的血栓可被溶解吸收，長久形成的血栓既不被溶解又不被充分機化時，可發(fā)生鈣鹽沉積，最終可形成靜脈石堵塞血管。Von Kossa染色是一種鈣質(zhì)染色法，可將鈣鹽沉積區(qū)染為黑色。本研究于術(shù)后1周血栓內(nèi)見散在鈣鹽沉積，血栓轉(zhuǎn)歸過程中隨著時間延長鈣鹽沉積增多。血栓內(nèi)出現(xiàn)鈣鹽沉積可以反映血栓形成處于晚期。

目前廣泛應(yīng)用的血管內(nèi)皮特異性標記物有CD31/CD34、Tie2、E9、TEC 等[9-11]，CD34 為血管內(nèi)皮細胞的特異性標記物，僅表達于血管內(nèi)皮細胞[12-13]。研究[14]發(fā)現(xiàn)，CD34參與血管內(nèi)皮損傷部位的血管新生、修復和保持血管內(nèi)皮完整。一般認為，除造血干細胞表達CD34外，微血管內(nèi)皮細胞也表達CD34[15]。熊正文等[16]研究認為，CD34相關(guān)抗原更敏感，能突出顯示較小的、不成熟的微血管或單一的內(nèi)皮細胞。本研究選用CD34作為血管內(nèi)皮的特異性標記物，最早于術(shù)后3d在血栓邊緣發(fā)現(xiàn)其少量陽性表達，術(shù)后2周新生小血管數(shù)量大量增加，并可見較大管腔血管。血栓內(nèi)部開始出現(xiàn)新生血管說明已處于血栓機化再通時期。

血小板、血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞廣泛參與了機體血栓形成的過程。在血栓形成及轉(zhuǎn)歸過程中，上述成分特定時間的病理學形態(tài)特點符合一般規(guī)律，但也有其特征性表現(xiàn)。單純的HE染色因其局限性很難對血栓形成時間進行細致劃分。本研究結(jié)果示：術(shù)后3 h可見CD61陽性表達并于術(shù)后1 d達高峰；術(shù)后3d見含鐵血黃素析出，α-SMA陽性表達；術(shù)后1周見鈣鹽析出，CD34陽性表達。含鐵血黃素、鈣鹽和CD34表達呈時間依從性的遞增趨勢。而α-SMA自術(shù)后1周達到峰值后呈下降趨勢，術(shù)后4周時表達重新增多可能由于新生血管的增多，在部分新生成毛細血管平滑肌內(nèi)表達。術(shù)后4周血栓與管腔形成的二次狹窄腔隙內(nèi)新生的白色血栓部位CD61重新表達，但表達量低于其峰值。上述指標參與了血栓形成，其起始出現(xiàn)的時間對于血栓形成時間推斷有一定意義：CD61可用于血栓形成3h及血栓再形成時期（4周）的時間推斷，含鐵血黃素、α-SMA可用于血栓形成3 d的時間推斷；鈣鹽、CD34可用于血栓形成1周的時間推斷。以上血栓形成不同時間的特異性特點可為血栓形成時間推斷提供參考依據(jù)。本研究在術(shù)后4周已發(fā)現(xiàn)CD61、α-SMA二次表達上調(diào)的趨勢；含鐵血黃素、鈣鹽和CD34自起始表達后呈時間依從性的遞增趨勢；且建模4周時結(jié)扎的大鼠下腔靜脈已有明顯側(cè)支循環(huán)的建立，血管再通明顯；4周后血栓形成時間推斷尚待進一步研究。

綜上所述，以上標記物在血栓形成過程中時序性出現(xiàn)的特點有望對血栓形成時間推斷提供新的思路。但由于血栓形成是一個動態(tài)的過程，本研究未進行4周后更長時間的研究，對于血栓形成時間的具體推斷仍需進行更深入的研究。以上研究所得僅在動物實驗得到確定，有待于在人體得到進一步驗證從而用于法醫(yī)學實踐過程。