張紅蕊 王耕銀 崔昌萌 黃 蕊 劉春梅 趙軼群 高曉紅 李春霞 李 偉 鄭 佳

(唐山市人民醫(yī)院，河北 唐山 063000)

糖尿病認知功能障礙(DMCI)嚴重影響患者生活質(zhì)量，很多學者認為發(fā)病機制與氧化應(yīng)激、海馬神經(jīng)元凋亡有關(guān)。目前認為核因子E2相關(guān)因子(Nrf)2-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號通路與DMCI有關(guān)，其抗氧化應(yīng)激作用是研究的熱點。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)是該通路激活后大量產(chǎn)生的抗氧化蛋白，是谷胱苷肽(GSH)合成的關(guān)鍵限速酶之一，由調(diào)節(jié)活力、催化活力兩部分亞單位組成。γ-GCS的含量活性改變可以直接影響GSH合成,轉(zhuǎn)錄表達水平升高時增強細胞的抗氧化應(yīng)激能力，保護中樞神經(jīng)。血紅素氧合酶(HO)-1，也是Nrf2通路中重要的抗氧化蛋白酶。Caspase-12即凋亡因子半胱氨酸天冬氨酸酶12，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)誘導凋亡的關(guān)鍵分子，表達量的變化可以反映ERS的活性，川陳皮素(NOB)主要提取于中藥陳皮中，同槲皮素共屬多甲氧基黃酮類化合物，在抗炎、抗氧化、營養(yǎng)神經(jīng)、肝保護〔1〕等方面有重要作用。本研究旨在探討NOB對糖尿病大鼠海馬γ-GCS、HO-1、Caspase-12表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 12周齡健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，清潔級，40只，體重(300±20)g，由華北理工大學動物實驗中心提供。按照華北理工大學動物實驗倫理委員會有關(guān)條例進行實驗操作。主要藥物及試劑：NOB(陜西慧科生物科技有限公司)、鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)、β-actin抗體(北京中杉金橋)、兔抗γ-GCS、HO-1、Caspase-12多克隆抗體(美國 KPL公司)、抗體稀釋液(碧云天生物科技研究所)、十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠試劑盒(碧云天生物科技研究所)、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)、SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳液粉劑(碧云天生物科技研究所)等。儀器設(shè)備：Morris水迷宮及分析軟件(中國醫(yī)學科學院藥物研究所研發(fā))、體重秤、高速低溫離心機、電泳轉(zhuǎn)移槽和垂直電泳儀(北京六一儀器廠)、溫控搖床(XMOOOLDR-MLM)(北京中西遠大)、凝膠成像分析系統(tǒng)(FluorChen 5500)(美國Thermo)。

1.2建立模型 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 w。禁食不禁水16 h后，隨機選取32只大鼠單次腹腔注射1%STZ(60 mg/kg)溶液〔由0.1 mol/L的枸櫞酸緩沖液(pH4.4)配制，濃度為10 g/L〕，72 h后用血糖儀檢測大鼠尾血非空腹血糖，兩次血糖值均>16.67 mmol/L者視為造模成功，進入實驗，余8只大鼠設(shè)為正常對照組，予等劑量緩沖液腹腔注射。

1.3分組及給藥 將造模成功的32只糖尿病大鼠，按照隨機數(shù)字表法分組：糖尿病組(n=8)，NOB高劑量組(n=6)、中劑量組(n=6)和低劑量組(n=6)，α-硫辛酸組(陽性對照組，n=6)。另8只大鼠設(shè)為正常對照組。選用NOB干預，按10 mg/kg,20 mg/kg 30 mg/kg劑量，分別予低、中、高三劑量組每日腹腔注射。陽性對照組每日予腹腔注射α-硫辛酸60 mg/kg。正常對照組、糖尿病模型組均予每日腹腔注射等量生理鹽水。以上6組均每日給藥1次，連續(xù)8 w。實驗期間動物自由進食水，常規(guī)飼料喂養(yǎng)。

1.4Morris水迷宮實驗 22周齡時，行Morris水迷宮行為學實驗(由固定人員完成，并不了解大鼠具體分組情況)。(1)定位航行實驗：在隔音及人工照明環(huán)境下，一共進行5 d的測試，每天記錄大鼠的成績。池水每天更換，約30 cm深，21～24℃水溫。圓形水池高50 cm，直徑214 cm，深30 cm，溫度約20℃，用4個標記點把水池分為4個象限，選一象限放置圓形平臺。大鼠面對池壁下水，記錄其爬到平臺時間。如果120 s內(nèi)未到站臺，則120 s為潛逃潛伏期。輪換進行，記錄成績。(2)空間探索實驗：實驗第6天時把平臺撤走，記錄120 s內(nèi)大鼠在目標象限停留的時間。

1.5灌注取材 水迷宮實驗結(jié)束后大鼠空腹過夜8 h。之后每組隨機選取4只大鼠進行心臟灌注，予10%水合氯醛(3.0 ml/kg) 行腹腔注射麻醉，開胸暴露心臟，行左心室插管，同時將右心耳剪開，用生理鹽水灌注，至眼球肝臟變白時，以4%中性多聚甲醛灌注固定，快速將腦組織完整取出，并迅速分離海馬組織，裝到凍存管，用液氮冷凍后，放置于-80℃冰箱儲存。

1.6Western印跡檢測 (1)制備蛋白樣品，將RIPA裂解液加到各組樣本中，充分裂解后，離心并取出上清。按照BCA法對蛋白濃度測定。(2)SDS-PAGE電泳：加好蛋白樣品后，恒壓電泳直到溴酚藍到凝膠底部時。(3)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜：通過半干轉(zhuǎn)法把蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。(4)封閉：取出膜后，封閉在3%牛血清白蛋白(BSA)-Tris-Hcl緩沖液(TBST)中，放在搖床上60 min。(5)孵育一抗：將1∶1 000稀釋的一抗加入，4℃搖床上過夜。TBST漂洗。(6)孵育二抗：將稀釋的二抗加入，室溫條件下?lián)u床上育60 min，TBST漂洗。(7)蛋白檢測：膜上加增強化學發(fā)光(ECL)反應(yīng)5 min。曝光膠片，顯影、定影。用凝膠成像分析系統(tǒng)分析條帶。

1.7統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件行方差分析和LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1定位航行實驗結(jié)果 在5 d的測試中，各組潛逃潛伏期均呈下降趨勢。第2天開始，與正常對照組相比，糖尿病組逃避潛伏期明顯延長(P<0.01)，提示STZ誘導糖尿病大鼠學習記憶能力顯著下降。從第3天開始，與糖尿病組比較，NOB各劑量組、陽性對照組潛逃潛伏期明顯縮短(P<0.05，P<0.01)，以高、中劑量組變化更顯著(P<0.01)，且高劑量與中劑量組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2空間探索實驗 與正常對照組相比，糖尿病組目標象限停留的時間顯著縮短(P<0.01)；與糖尿病組相比，NOB各劑量組、陽性對照組目標象限停留時間均延長(P<0.05，P<0.01)，以中、高劑量組更為顯著(P<0.01)，但未恢復正常，且高劑量與中劑量組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表明川陳皮素可以緩解記憶能力的損傷。見表1。

表1 各組Morris水迷宮實驗中潛逃潛伏期、目標象限停留時間比較

與正常對照組比較：1)P<0.01;與糖尿病組比較：2)P<0.05，3)P<0.01，下表同

2.3Western印跡檢測結(jié)果 正常對照組海馬CA1區(qū)γ-GCS、HO-1、Caspase-12低水平表達。糖尿病組海馬CA1區(qū)γ-GCS、HO-1、Caspase-12表達水平較正常對照組明顯增加(P<0.01)。與糖尿病組比較，NOB各劑量組、陽性對照組海馬CA1區(qū)γ-GCS、HO-1表達明顯升高(P<0.05，P<0.01),而Caspase-12表達均有所下降(P<0.05，P<0.01)，以NOB中、高劑量組變化最顯著(P<0.01)，但高劑量與中劑量組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1、表2。

圖1 各組海馬CA1區(qū)γ-GCS、HO-1、Caspase-12表達

表2 各組海馬CA1區(qū)γ-GCS、HO-1、Caspase-12的表達

3 討 論

海馬結(jié)構(gòu)與學習記憶能力密切相關(guān)，研究認為DMCI時海馬結(jié)構(gòu)功能受損。高血糖可透過血腦屏障損害神經(jīng)元而降低患者學習、推理、記憶等能力。自由基氧化應(yīng)激損傷學說及ERS誘導凋亡是近年來研究的熱點〔2〕，認為二者均與DMCI有關(guān)。

正常情況下GSH和80%的γ-GCS結(jié)合使細胞失活,在GSH減少時與其結(jié)合的γGCS釋放就會增加,γ-GCS的水平隨之升高。有報道〔3〕Nrf2-ARE信號通路激活可以減少GSH的消耗、神經(jīng)興奮性毒素等對神經(jīng)元的損害，增加神經(jīng)元的能量、氧化還原電位抑制性神經(jīng)遞質(zhì)信號和代謝過程，起到保護中樞神經(jīng)的作用。Nrf2是抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中重要的轉(zhuǎn)錄因子，ARE與其相互作用，調(diào)節(jié)下游抗氧化蛋白的表達〔4〕，在減輕細胞損傷中具有重要的作用〔5〕，對糖尿病氧化應(yīng)激腦損傷起到保護作用。萊菔硫烷可激活Nrf2-ARE抗氧化通路，上調(diào)下游的Ⅱ相酶如HO-1等的表達，清除自由基，減少腦皮質(zhì)細胞凋亡及保護血-腦脊液屏障〔6〕。外源性或內(nèi)源性應(yīng)激激活Nrf2后，可以上調(diào)γ-GCS、HO-1表達水平。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)容易受機體內(nèi)環(huán)境的影響，氧化應(yīng)激即可破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，導致未折疊蛋白的聚集或者錯誤折疊，從而引發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)。此反應(yīng)一定程度上有保護作用，但是過度時將通過ERS導致相關(guān)性細胞凋亡。Caspase-12是ERS通路中一種重要的調(diào)控蛋白，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。其表達水平在腦缺血再灌注損傷后明顯升高。高糖可使ERS反應(yīng)激活，活化的Caspase-12可激活Caspase-3、Caspase-9引起細胞凋亡。NOB有抗炎、抗氧化〔7〕、抗癌、抗血小板聚集、抗動脈粥樣硬化〔8〕等作用。有報道〔9〕黃酮類化合物甘草黃酮也可以增強糖尿病大鼠抗氧化能力，降低丙二醛(MDA)水平，可推斷NOB在糖尿病大鼠DMCI中可具有此作用；枳實、陳皮含有NOB、桔皮素活性成分，對缺血性腦卒中有一定的預防作用；研究〔10〕提出，NOB可以減輕大鼠腦缺血后腦水腫、神經(jīng)功能受損而保護中樞神經(jīng)；NOB可改善阿爾茨海默病大鼠的認知功能,有效改善腦缺血導致的認知功能下降。

本實驗結(jié)果顯示，正常對照組大鼠海馬神經(jīng)元中有少量的γ-GCS、HO-1、Caspase-12的表達，考慮為生理狀況下的表達量。糖尿病大鼠出現(xiàn)嚴重的認知功能障礙，學習記憶能力損傷嚴重，表現(xiàn)為大鼠潛逃潛伏期延長、在空間探索實驗中目標象限停留時間縮短，海馬CA1區(qū)γ-GCS、HO-1、Caspase-12表達量較正常組升高，一方面考慮是大鼠高血糖透過血腦屏障，導致氧化應(yīng)激增強產(chǎn)生大量有毒物質(zhì)從而損傷了海馬神經(jīng)元；另一方面是高糖致ERS誘導海馬神經(jīng)元的凋亡，活化的Caspase-12表達水平上升進一步激活其他凋亡因子的表達而損害神經(jīng)元。這種情況下，機體啟動Nrf2-ARE通路，轉(zhuǎn)錄因子Nrf2活性增強、表達增多，通過與ARE作用，增加γ-GCS、HO-1等表達，抵御氧化應(yīng)激對神經(jīng)元的損害。NOB治療大鼠認知功能改善，γ-GCS、HO-1表達量升高，NOB可能會使γ-GCS、HO-1表達增多而增強組織細胞抗氧化能力，保護海馬神經(jīng)元；Caspase-12表達水平下降，表明NOB可以抑制海馬細胞凋亡，減輕認知功能損傷，機制可能與過度的未折疊蛋白反應(yīng)中下調(diào)Caspase-12表達量等有關(guān)。將來可細化NOB的藥物作用濃度，更深入地探討NOB對DMCI的作用強度的曲線變化。

綜上，NOB對改善糖尿病大鼠認知功能障礙有較好的作用，表明NOB可以保護海馬神經(jīng)元，機制可能與Nrf2-ARE信號通路激活導致γ-GCS、HO-1等抗氧化應(yīng)激因子大量表達及抵抗在過度的未折疊蛋白反應(yīng)中Caspase-12途徑所致的細胞凋亡相關(guān)。