張淑華 洪 浪 王云霞 吳志婷 劉秋玲 葛郁芝

(江西省人民醫(yī)院 江西省心血管病研究所，江西 南昌 330006)

細胞凋亡是指機體在有害物質(zhì)、破損細胞等體內(nèi)外誘導因素下激活細胞內(nèi)某些編碼基因而導致的細胞死亡，是程序性死亡的一種〔1〕。microRNA(miR)通過對靶基因轉(zhuǎn)錄后表達調(diào)控，廣泛參與細胞的增殖、分化、病變、修復和凋亡等多種生命活動〔2〕。大量研究表明miRs參與急性心肌梗死、缺血再灌注、氧化應(yīng)激等多種情況下心肌細胞凋亡的調(diào)控〔3～5〕，另有報道肥大的心肌細胞更容易發(fā)生凋亡〔6〕。從壓力超負荷心肌肥厚大鼠的心肌組織中篩選到異常表達的miR-350〔7〕，并對其作用機制進行探索，研究過程中發(fā)現(xiàn)miR-350引起細胞肥大的同時，心肌細胞凋亡也增加。該現(xiàn)象是否和miR-350有直接關(guān)系呢？心肌細胞為終末分化細胞，不具有再生和增殖能力，而大量心肌細胞凋亡，死亡是多種心血管疾病導致的心臟功能損害由代償性向失代償轉(zhuǎn)變的重要因素〔8〕。明確心肌細胞凋亡機制對心血管疾病的預防與治療有著重要意義。本研究利用特殊化學修飾的miR拮抗劑抑制miR-350的表達，從正反兩個方向深入研究。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠胚胎心肌細胞H9c2細胞購自ATCC；杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、胰酶、抗生素、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)等購自Gibco公司。胎牛血清購自PAA公司，F(xiàn)uGene HD購自Roche公司，Trizol購自Invitrogen公司，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司，RNasin和dNTP購自TaKaRa公司。AnnexinV-PE凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司，核酸序列均由上海生工合成。miR-350基因序列：GTGAAAGTGTATGGGCTTTGGGAATTCAAGAGATTCACA AAGCCCATACACTTTCAC；miR-350拮抗劑(antagomir)序列：5′-GUGAAAGUGUAUGGGCUUUGUGAA-3′ (miR-350 anti)。miR-350突變(mutant)序列：5′-GUCAAUGUGAUAGCGCUCACGUAA-3′(miR-350-NC)。

1.2細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 H9c2細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于含5%CO2的37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞轉(zhuǎn)染前1 d換成無雙抗的培養(yǎng)基。選用轉(zhuǎn)染試劑FuGene HD將含miR-350及相關(guān)核酸的載體及shRNA-JNK/p38轉(zhuǎn)染H9c2細胞。細胞分組：對照(Control)組(未處理的H9c2細胞)；Mutant組(H9c2細胞轉(zhuǎn)染miR-350突變序列過表達載體)；miR-350組(H9c2細胞轉(zhuǎn)染miR-350過表達載體)；shRNA-JNK/p38組(H9c2細胞轉(zhuǎn)染shRNA-JNK/p38過表達載體)；miR-350+anti組(H9c2細胞共轉(zhuǎn)染miR-350和miR-350 antagomir)；血管緊張素(Ang)Ⅱ組(AngⅡ處理H9c2細胞)。

1.3細胞表面積的檢測 上述各組細胞分別于處理后1、3、5、7 d拍照，并應(yīng)用Image J軟件分析細胞心肌細胞表面積。

1.4MTT法檢測細胞相對活力 H9c2細胞種于96孔板，按上述方法進行分組，分別轉(zhuǎn)染2 μg Mock、miR-350和shRNA-JNK/p38質(zhì)粒及給藥AngⅡ(1 mg/ml)1、2、3、4、5 d后，細胞用胰酶消化重懸，細胞懸液用0.4%(g/ml)的臺盼藍等體積稀釋，取10 μl加到細胞計數(shù)板，靜置3 min，顯微鏡下計數(shù)。細胞數(shù)/ml=(4大格細胞總數(shù)/4)×10 000×稀釋倍數(shù)。并用紫外分光光度計測定A540，計算細胞相對活力百分比。

1.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 H9c2細胞種于6孔板，分別轉(zhuǎn)染2 μg Mutant、miR-350質(zhì)粒，給藥AngⅡ(1 mg/ml)，于第3天用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化收集，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次(2 000 r/min離心5 min)，收集(1～5)×105細胞，用500 μl的結(jié)合緩沖液懸浮細胞，加入5 μl Annexin V-PE對細胞染色。室溫、避光、靜置5～15 min后；將細胞懸液混勻；于1 h內(nèi)，進行流式細胞儀的檢測。

1.6miR-350對細胞p38和JNK基因表達影響 用miR-350 antagomir和miR-350共轉(zhuǎn)染H9c2細胞，試圖阻滯miR-350的活性，觀察靶基因p38和JNK的表達變化。細胞分四組：Control組、miR-350組、miR-350+anti共轉(zhuǎn)染組和shRNA-JNK/p38組。常規(guī)消化收集處理48 h的細胞，提取總蛋白和總 RNA，分別行Western印跡和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的方法檢測JNK和MAPK14的蛋白和mRNA表達。蛋白印跡實驗的膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈光密度值。PCR產(chǎn)物在質(zhì)量分數(shù)2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)成像并測定光密度值(A值)，以β-肌動球蛋白(actin)為內(nèi)參照，將AJNK/Aβ-actin及AMAPK14/Aβ-actin的比值進行統(tǒng)計學分析。實驗重復3次。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-350 誘導H9c2細胞肥大 與Control組相比，轉(zhuǎn)染第7天，AngⅡ組和shRNA-JNK/p38組細胞發(fā)生肥大(P<0.05)；miR-350組細胞肥大顯著(P<0.01)；而miR-350+anti組及Mutant組細胞未見明顯變化(P>0.05)。見表1。

表1 各組H9c2細胞加藥處理后不同時間點細胞相對大小的變化

與Control組比較:1)P<0.05，2)P<0.01;下表同

2.2miR-350 抑制細胞增殖 轉(zhuǎn)染miR-350和shRNA-JNK/p38后1～5 d，細胞活力呈時間依賴性下降。與Control組相比，轉(zhuǎn)染后3～5 d miR-350組細胞活性顯著下降(P<0.05)；shRNA-JNK/p38組細胞活性抑制最為顯著(P<0.01)；而miR-350+anti組、Mutant組及AngⅡ組細胞活性均未發(fā)生明顯變化(P>0.05)。見表2。

2.3miR-350誘導H9c2細胞凋亡 心肌細胞轉(zhuǎn)染miR-350組、shRNA-JNK/p38組、miR-350和miR-350 anti組及AngⅡ組細胞處理60 h后，各組細胞通過Annexin V和PI共染色法測定細胞凋亡情況。Control組細胞凋亡率為0.06%，miR-350+anti組細胞凋亡率為0.79%，AngⅡ誘導組細胞的凋亡率是2.4%，shRNA-JNK/p38組和miR-350組的凋亡率分別是16.36%和8.39%；與Control組相比，miR-350和shRNA-JNK/p38組凋亡率顯著提高(P<0.05,P<0.01)。見圖1。

2.4miR-350 對H9c2細胞p38和JNK的表達影響 miR-350的過表達可在轉(zhuǎn)錄水平抑制內(nèi)源性p38和JNK基因的表達。而且，miR-350-anti能夠明顯抑制miR-350活性，阻止miR-350對靶基因的影響。與Control組相比，miR-350+anti組細胞p38和JNK基因和蛋白質(zhì)均無顯著變化。見圖2。

表2 各組H9c2細胞加藥處理后不同時間點細胞相對活力

圖1 流式細胞儀檢測細胞凋亡

圖2 各組靶基因p38和JNK的表達水平PCR和Western印跡結(jié)果

3 討 論

本研究前期結(jié)果顯示miR-350通過抑制靶基因p38和JNK的表達，影響NFATc的轉(zhuǎn)核介導心肌肥大〔9，10〕。研究過程中發(fā)現(xiàn)miR-350抑制H9c2細胞肥大的同時，細胞增殖受到抑制，死亡細胞增多。p38和JNK的信號轉(zhuǎn)導通路是MAPK通路的一個重要分支，它在細胞周期、生長、凋亡和細胞應(yīng)激等多種生理和病理過程中起重要作用〔11〕。細胞凋亡的增加和心肌肥厚和心衰有關(guān)。

為了從正反兩個方面探索miR-350和凋亡的關(guān)系，將miR-350 antagomir與miR-350過表達載體共轉(zhuǎn)染H9c2細胞，抑制miR-350的表達。結(jié)果如預期一致，轉(zhuǎn)染miR-350-anti的細胞miR-350表達水平受到明顯抑制，而p38和JNK基因表達水平無變化；從細胞大小定量分析的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，miR-350-anti明顯改善了miR-350導致的細胞肥大；并且有效地阻止了miR-350引起的細胞凋亡。這些結(jié)果均表明，miR-350誘導心肌細胞病理性肥大的同時，可以促進細胞凋亡。miR-350這種生物學活性可以有效地被miR-350 antagomir阻滯。

推測miR-350誘導H9c2細胞凋亡，也是通過抑制靶基因p38和JNK的表達介導的。miR-350引起心肌細胞凋亡可能是擴張型心肌病及心力衰竭晚期的一個重要因素，miR-350導致的細胞凋亡在調(diào)節(jié)肥厚反應(yīng)和隨后心力衰竭的進展中起至關(guān)重要作用。調(diào)控miR表達可以有效影響心肌細胞凋亡進程，為心血管疾病的預測、診斷與治療提供了新的思路。