單宇佳，王華新，趙立芬，劉 兵，楊佩滿 ，吳文國，賈 莉

(1大連醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連 116044；2大連醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)與法醫(yī)學(xué)教研室，遼寧大連 116044；3大連醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室，遼寧大連 116044； 4大連金斧生物科技發(fā)展有限公司， 遼寧大連 116012)

再生障礙性貧血是由多種病因、多種發(fā)病機(jī)理引起的一種惡性血液疾病。臨床實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，再障中骨髓造血細(xì)胞數(shù)量極度減少，嚴(yán)重限制了對(duì)再障發(fā)病機(jī)制的研究，獲得性骨髓衰竭的動(dòng)物模型可以幫助深入了解引起骨髓衰竭的機(jī)制[1-3]。大多數(shù)再障患者會(huì)出現(xiàn)厭食、惡心及其他胃腸道癥狀，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)不足[4]。再障的治療以免疫抑制治療為主，患者接受治療后，會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的消化功能障礙，電解質(zhì)不平衡和代謝異常，出現(xiàn)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)大大增加[5-7]。因此，營(yíng)養(yǎng)干預(yù)成為再障患者治療前后應(yīng)考慮的重要問題。研究表明，營(yíng)養(yǎng)組合物在再障小鼠營(yíng)養(yǎng)康復(fù)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[8-9]。本研究采用X射線、環(huán)磷酰胺、氯霉素三聯(lián)應(yīng)用的方法建立再障大鼠模型，探討自制營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)再生障礙性貧血大鼠各器官干細(xì)胞增殖的影響，旨在為營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)再障的臨床治療應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠100只，大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；營(yíng)養(yǎng)組合物，大連金斧生物科技發(fā)展有限公司，該組合物包含賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、核苷酸、大豆磷脂、維生素C、維生素D、維生素B12、葉酸、鐵、硒等36種物質(zhì)組成，按原方比率配方，經(jīng)水煎、超聲、濃縮，配制成口服液，分裝備用；環(huán)磷酰胺、氯霉素，上海華聯(lián)制藥有限公司；兔抗大鼠CD90、CK19 抗體，兔抗大鼠CD133、OCT4抗體，兔抗大鼠Lgr5、Musashi-1抗體，兔抗大鼠Nestin、CD133抗體，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；羊抗兔二抗及SP免疫組化檢測(cè)試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 大鼠再障模型的建立

第1天X射線2.5Gy(美國瓦里安2 300C/D，6 MV，X射線，照射距離25cm，劑量率300 cGy /min)照射后，于第4、6、8天分別給予環(huán)磷酰胺35mg/kg、氯霉素45 mg/kg腹腔注射。第15天重復(fù)以上步驟。正常對(duì)照組給予等量生理鹽水相應(yīng)部位注射。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及流程

根據(jù)動(dòng)物藥理學(xué)的藥品劑量和綜合實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)準(zhǔn)則，本實(shí)驗(yàn)分為：(1)正常對(duì)照組；(2)再障模型組；(3)營(yíng)養(yǎng)組合物高劑量組，以2 266.95mg/(kg·d)對(duì)大鼠灌胃；(4)營(yíng)養(yǎng)組合物中劑量組，以1 511.3mg/(kg·d)對(duì)大鼠灌胃；(5)營(yíng)養(yǎng)組合物低劑量組，以1 057.91mg/(kg·d)對(duì)大鼠灌胃，每組20 只。

實(shí)驗(yàn)流程：應(yīng)用X射線照射及注射環(huán)磷酰胺、氯霉素的方法建立再障大鼠模型。從第5天開始，營(yíng)養(yǎng)組合物高、中、低劑量組分別以相應(yīng)劑量對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃，每天1次，直至第60天，頸椎脫臼處死大鼠，留取對(duì)應(yīng)的樣品標(biāo)本進(jìn)行后期檢測(cè)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

將處死的SD大鼠解剖，留取肝臟、腎臟、胃、腸、腦標(biāo)本，置于10%甲醛中固定，依次經(jīng)過常規(guī)脫水、石蠟浸泡包埋、切片后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。步驟如下：石蠟包埋切片、脫蠟、水化；PBS洗片2～3次，每次5min；在玻片上滴加3% H2O2(80%甲醇)，室溫靜置10min；PBS洗2～3次各5min；抗原修復(fù)；PBS洗2～3次各5min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min。滴加一抗50μL，4℃過夜。過夜后需在37℃復(fù)溫45min。PBS洗3次各5min；滴加二抗40～50μL，室溫靜置，或37°C 1h；PBS洗3次各5min；DAB顯色5～10min，在顯微鏡下掌握染色程度；PBS或自來水沖洗10min；蘇木精復(fù)染2min，鹽酸酒精分化；自來水沖洗10～15min；脫水、透明、封片、鏡檢。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)再障大鼠肝臟干細(xì)胞的影響

本研究采用免疫組化檢測(cè)再障大鼠肝干細(xì)胞標(biāo)志物CD90、細(xì)胞角蛋白19(CK19)的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，再障模型組大鼠肝干細(xì)胞數(shù)量明顯減少(圖1)，再障大鼠經(jīng)營(yíng)養(yǎng)組合物灌胃后，大鼠肝干細(xì)胞的含量增加，并且隨著營(yíng)養(yǎng)組合物劑量增加而增加，表明營(yíng)養(yǎng)組合物促進(jìn)再障大鼠肝干細(xì)胞的增殖。

2.2 營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)再障大鼠腎臟干細(xì)胞的影響

本研究采用免疫組化檢測(cè)再障大鼠腎臟干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、OCT4的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，再障模型組大鼠CD133、OCT4的表達(dá)量顯著降低(圖2)，營(yíng)養(yǎng)組合物處理再障大鼠后，其表達(dá)量隨營(yíng)養(yǎng)組合物劑量增加而增加，表明營(yíng)養(yǎng)組合物促進(jìn)再障大鼠腎臟干細(xì)胞的增殖。

2.3 營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)再障大鼠胃干細(xì)胞的影響

本研究采用免疫組化檢測(cè)再障大鼠胃干細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)gr5及Musashi-1的表達(dá)。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，再障模型組大鼠胃干細(xì)胞Lgr5的表達(dá)量明顯減少(圖3)；營(yíng)養(yǎng)組合物處理再障大鼠后，Lgr5的表達(dá)隨營(yíng)養(yǎng)組合物劑量增加而增多；然而各組胃干細(xì)胞Musashi-1的表達(dá)無明顯變化。以上結(jié)果表明，營(yíng)養(yǎng)組合物具有促進(jìn)再障大鼠胃干細(xì)胞的增殖。

圖1 營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)再障大鼠肝臟干細(xì)胞的影響(400×)注：# P<0.05 再障組與正常組；*P<0.05 營(yíng)養(yǎng)組合物組與再障組

圖2 營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)再障大鼠腎臟干細(xì)胞的影響(400×)注：# P<0.05再障組與正常組；*P<0.05營(yíng)養(yǎng)組合物組與再障組

圖3 營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)再障大鼠胃干細(xì)胞的影響(200×)注：# P<0.05 再障組與正常組；*P<0.05 營(yíng)養(yǎng)組合物組與再障組

2.4 營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)再障大鼠腸粘膜干細(xì)胞的影響

本研究采用免疫組化檢測(cè)再障大鼠腸道干細(xì)胞標(biāo)志物Musashi-1、 Lgr5的表達(dá)。結(jié)果顯示，各組小腸干細(xì)胞數(shù)量無明顯變化(圖4)，表明營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)再障大鼠小腸干細(xì)胞的增殖無顯著作用。

圖4 營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)再障大鼠肝臟干細(xì)胞的影響(200×)注：# P<0.05 再障組與正常組；*P<0.05 營(yíng)養(yǎng)組合物組與再障組

2.5 營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)再障大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的影響

本研究采用免疫組化檢測(cè)再障大鼠神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin、CD133的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，營(yíng)養(yǎng)組合物處理再障大鼠后，Nestin、CD133的表達(dá)無顯著變化(圖5)，表明營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)再障大鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞的增殖無顯著影響。

圖5 營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)再障大鼠肝臟干細(xì)胞的影響(400×)注：# P<0.05再障組與正常組；*P<0.05營(yíng)養(yǎng)組合物組與再障組

3 討論

引起再生障礙性貧血(AA)的主要原因?yàn)門 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能發(fā)生紊亂，其發(fā)病機(jī)理為T 淋巴細(xì)胞發(fā)生異常激活，進(jìn)而分泌過量的造血負(fù)調(diào)控因子，通過某些機(jī)制抑制造血干/祖細(xì)胞增殖分化，從而誘導(dǎo)造血干細(xì)胞凋亡，在此過程中表現(xiàn)為明顯的抑制骨髓造血活性[10]。大多數(shù)嚴(yán)重再障患者采用抗胸腺細(xì)胞球蛋白和環(huán)孢菌素進(jìn)行免疫抑制治療來改善血細(xì)胞計(jì)數(shù)及存活率[11]。再障患者另一治療選擇為異基因造血干細(xì)胞移植[12]。此外，支持治療、預(yù)防感染和輸血支持對(duì)于再障患者也是至關(guān)重要的[13]。雖然臨床上已有較完善的治療方法和指征，但實(shí)際療效仍然不理想。因此，探討營(yíng)養(yǎng)組合物治療再障大鼠的可能作用機(jī)制具有較高的臨床意義。

營(yíng)養(yǎng)組合物含有多種氨基酸、磷脂、核苷酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分，其中腦磷脂、卵磷脂是線粒體及造血干細(xì)胞組分，甘氨酸參與合成甘氨酰胺合成酶參加嘌呤核苷酸合成。據(jù)報(bào)道，營(yíng)養(yǎng)組合物具有促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖和增強(qiáng)血紅蛋白合成的功能。此外，核苷酸類營(yíng)養(yǎng)物不僅有助于基因的復(fù)制、損傷基因的自主修復(fù)、基因表達(dá)，也有助于線粒體的增殖[14]。有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在AA小鼠模型中，營(yíng)養(yǎng)組合物對(duì)骨髓造血微環(huán)境有明顯的保護(hù)和修復(fù)作用，可促進(jìn)小鼠干細(xì)胞增殖和增加線粒體的數(shù)目[15]。

Wilson等[16]證實(shí)了增殖的卵圓細(xì)胞可分化為成熟的肝細(xì)胞及膽管細(xì)胞，并指出這類細(xì)胞為肝臟內(nèi)原始肝干細(xì)胞。國內(nèi)研究報(bào)道，當(dāng)肝臟受到藥物刺激或其他原因造成嚴(yán)重?fù)p傷肝時(shí)，卵圓細(xì)胞可被激活并增殖、分化為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞，使得肝功能得以重建和修復(fù)[17]。腎小管上皮細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用，在腎組織損傷修復(fù)過程中具有強(qiáng)大的再生能力[18-22]，這種強(qiáng)效的再生可有效恢復(fù)腎臟功能。腎臟組織干細(xì)胞對(duì)于維持腎臟功能至關(guān)重要[23-24]。胃腸道干細(xì)胞具有分化為胃腸組織中幾乎所有的細(xì)胞的能力，對(duì)維持胃腸黏膜更新及保持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著至關(guān)緊要的作用[25]。神經(jīng)干細(xì)胞來源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可以修復(fù)損傷的神經(jīng)系統(tǒng)。以上干細(xì)胞均屬于成體干細(xì)胞，其來源之一為骨髓造血干細(xì)胞的分化。本實(shí)驗(yàn)顯示，營(yíng)養(yǎng)組合物可使AA大鼠的肝臟、腎臟、胃的干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)增加，但對(duì)AA大鼠的腸粘膜和神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)無影響，說明營(yíng)養(yǎng)組合物在一定程度上可促進(jìn)AA大鼠肝臟、腎臟、胃干細(xì)胞的增殖，而對(duì)腸粘膜和神經(jīng)干細(xì)胞的增殖無顯著差異作用。此過程中其潛在的可能機(jī)制為營(yíng)養(yǎng)組合物可促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞向肝、腎、胃干細(xì)胞的發(fā)育、增殖、分化，改善骨髓造血微環(huán)境或骨髓重建?！?/p>