王 海，何成彥，令狐志宏，宋麗娜

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗科，吉林 長春130033)

真核延伸因子2 (eEF2)是一種GTP依賴的轉(zhuǎn)位酶，可介導(dǎo)核糖體的移位，因此與蛋白質(zhì)的延伸和翻譯密切相關(guān)[1]。eEF2主要受eEF2K (真核延伸因子2激酶)的調(diào)控，是蛋白質(zhì)合成過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用[2-5]。本研究以純化的eEF2融合蛋白為抗原免疫Bal b/c小鼠，制備eEF2單克隆抗體，探究大腸癌組織中eEF2的表達情況，為進一步研究其對大腸癌生物學(xué)行為的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1材料

主要試劑有不完全弗氏佐劑、完全弗氏佐劑購自 Sigma公司，胎牛血清、RPMI 1640 購自Gibco公司，100×HT、100×HAT、PEG 4000購自Sigma 公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉素抗生物素蛋白工作液(S-A/HRP)、山羊抗鼠Ig G(H+L)-HRP購自CW bio。

1.2實驗方法

1.2.1小鼠的免疫 首次免疫選取6周齡的雌性Bal b/c小鼠，將純化的eEF2融合蛋白與完全弗氏佐劑按1∶1的比例混合乳化后在小鼠背部皮下進行多點免疫。2周后進行第二次免疫(不完全弗氏佐劑)。再兩周后進行第三次加強免疫(不完全弗氏佐劑)。3天后從小鼠的尾靜脈采血，用ELISA法檢測抗體效價。

1.2.2間接ELISA法檢測抗體效價 取濃度為2 μg/ml的eEF2抗原包被聚苯乙烯微孔板，每孔100 μl，4℃過夜。洗板后每孔加封閉液150 μl，37℃放置2小時，洗板后加入1∶1000、1∶3000、1∶9000、1∶27000等倍比稀釋的待測血清、空白對照和陰性對照，每孔100 μl， 37℃孵育30 min，洗板。每孔加入1∶5 000倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 100 μl，37℃孵育30 min，洗板。每孔加入1×TMB 100 μl，37℃避光顯色20 min。加入終止液。用酶標(biāo)儀測定OD450nm，測定孔與陰性對照孔的比值(P/N)>2.1為確定效價的臨界點。

1.2.3細胞融合及陽性克隆篩選 將骨髓瘤細胞Sp2/0與小鼠脾細胞以1∶10的比例混合,用50%PEG為融合劑，將融合細胞加入96孔板中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。于細胞融合后第8-14天，取細胞上清，用間接ELISA方法進行篩選。

1.2.4單克隆抗體大量制備 取12周齡Bal b/c小鼠，腹腔內(nèi)注射0.5 ml滅菌的石蠟油，1周后接種 2×106個細胞/ml生理鹽水，觀察腹水的產(chǎn)生情況。1-2周后收集腹水，離心收集上清，間接ELISA法檢測效價。

1.2.5采用親和層析法純化腹水抗體 用protein G親和層析法純化抗體。

1.2.6Western Blot 鑒定制備出的eEF2單克隆抗體的特異性 以純化的eEF2融合蛋白上樣，進行Western blot測定,以制備的eEF2單克隆抗體為一抗,HRP-羊抗鼠IgG為二抗,用ECL溶液進行顯影分析。

1.2.7應(yīng)用制備的單克隆抗體對大腸癌組織進行免疫組化染色 大腸癌組織切片用二甲苯脫蠟；水化；檸檬酸鈉抗原修復(fù)；3%H2O2室溫孵育；5%兔血清封閉；滴加一抗(制備的eEF2單克隆抗體)、二抗(HRP-羊抗鼠IgG)、S-A/HRP；DAB顯色；蘇木素復(fù)染；0.1%鹽酸分化；梯度酒精逐級脫水；二甲苯透明；中性樹脂封片。顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1WesternBlot結(jié)果

將純化的eEF2融合蛋白進行Western Blot 鑒定，一抗用本研究制備的eEF2單克隆抗體，二抗用山羊抗鼠Ig G。如圖1所示，該單抗可與eEF2融合蛋白特異性結(jié)合，可確定其為eEF2的特異性抗體。

圖1 Western Blot結(jié)果

2.2大腸癌組織的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果

應(yīng)用制備的單克隆抗體對大腸癌組織切片進行免疫組化染色，陽性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)為：細胞內(nèi)出現(xiàn)清晰的棕褐色或棕黃色顆粒。如圖2所示，大腸癌組織中的eEF2主要表達在細胞漿。

圖2 eEF2在大腸癌組織中的表達(╳200)

3 討論

自從開發(fā)抗體生產(chǎn)技術(shù)以來，已經(jīng)有許多抗體被研發(fā)并應(yīng)用于免疫學(xué)、生物技術(shù)、診斷學(xué)和治療藥物以及科研領(lǐng)域。多克隆抗體最常用，但不同批次之間具有性能差異，每個新批次需要進行驗證，同時，多克隆抗體含有大量不同濃度的具有未知特異性的不同抗體。相反，單克隆抗體性能一致，是具有高度特異性的一類生物試劑[6]，因此現(xiàn)在的很多研究都用單克隆抗體代替多克隆抗體，以提高實驗的穩(wěn)定性和特異性。應(yīng)用于抗體研發(fā)的方法有很多，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)開發(fā)的第一種單克隆抗體于1975年報道，隨后于1986年獲得許可[7]，本研究應(yīng)用該方法制備了具有高特異性的eEF2單克隆抗體，為將來對eEF2的研究工作奠定了基礎(chǔ)。研究顯示，eEF2蛋白在食管癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等多種腫瘤組織中過表達[8-12]，并且它可以促進細胞周期的G2/M的進展，并伴隨著Akt和G2 / M調(diào)節(jié)劑cdc2蛋白的激活，導(dǎo)致體外增強和體內(nèi)癌細胞生長[13]。然而，eEF2在腫瘤發(fā)生中的作用仍然大部分未知，此外，eEF2基因產(chǎn)物是免疫原性的，eEF2是否可以成為癌癥的免疫療法的靶分子仍有待進一步深入研究。