遲魯梅,龔秀玲,于 驍,吳坤軍,沈 靜,高 宇*
(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,吉林 長(zhǎng)春130033;2.上海市嘉定區(qū)南翔醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,上海201800)
在我國(guó),腦梗死是導(dǎo)致死亡和成人致殘的第一位原因。盡管醫(yī)學(xué)上對(duì)腦梗死的治療已取得了不斷的進(jìn)步,每年仍至少有200萬(wàn)新發(fā)的腦梗死患者,卒中死亡占所有死亡原因的22.45%[1]。近年來,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)治療為腦梗死患者帶來了新的希望。目前對(duì)BMSCs的研究主要在急性期,本實(shí)驗(yàn)主要探討亞急性期靜脈給予人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能的影響。
1.1實(shí)驗(yàn)材料
hBMSCs(ScienCell公司,No.7500;ScienCell),高糖DMEM培養(yǎng)液(CEFOgro BMMSC),胎牛血清(SH30084.03,Hyclone),Trypsin-EDTA(Gibco,Canada),雄性SD大鼠(遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司),冰凍切片機(jī)(Lecia CM1900),Image J軟件(Image J;NIH,Bethesda,MD)。
1.2方法
1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) hBMSCs原代細(xì)胞種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基中,將細(xì)胞放于37℃,5%二氧化碳的標(biāo)準(zhǔn)濕化孵育箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行傳代。取第3-5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1.2.2腦缺血再灌注模型的制備和實(shí)驗(yàn)分組 選用250-300克的雄性SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。所有大鼠的飼養(yǎng)溫度為(20±2)℃,自由攝食和飲水,保持12小時(shí)輪換開燈關(guān)燈的作息時(shí)間,大鼠在大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型制備前1天禁食,模型制備前4小時(shí)禁水。采用線栓法[2]制備大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型。造模成功后2小時(shí),拔出線栓,實(shí)現(xiàn)再灌注。
將大鼠隨機(jī)分為2組,對(duì)照組(MCAO模型)和治療組(MCAO+hBMSCs),兩組大鼠分別在再灌注14天注射等量的2 mlPBS和2×106個(gè)hBMSCs。實(shí)驗(yàn)過程中不使用免疫抑制劑。
1.2.3大鼠行為功能測(cè)試 實(shí)驗(yàn)大鼠的行為功能測(cè)試由不了解實(shí)驗(yàn)分組的實(shí)驗(yàn)員進(jìn)行。mNSS評(píng)分,limb placement 評(píng)分,Corner test 評(píng)分在造模后1天、14天、21天、35天、42天進(jìn)行。mNSS評(píng)分參照王利平[3],Limb placement評(píng)分參照M De Ryck等[4],Corner test參照Z(yǔ)hang等[5]。
1.2.4梗死體積的測(cè)定 造模后第42天,所有大鼠麻醉后,通過心臟灌洗冰鹽水處死,取出腦組織放于4%的福爾馬林中浸泡24小時(shí),然后浸入30%的蔗糖溶液中,48小時(shí)后,待腦組織沉底后,取出腦組織,放入-70℃冰箱中保存。24小時(shí)后取出冰凍的腦組織,在冰凍切片機(jī)中切成30 μm的薄片。進(jìn)行Nissl染色。通過Image J軟件測(cè)量梗死體積。梗死體積的表示方法為:病灶的體積/對(duì)側(cè)大腦半球的體積。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用 SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD) 表示,采用t檢驗(yàn)的方法對(duì)兩組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1兩組大鼠的mNSS功能評(píng)分結(jié)果
對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在第1,14,21,35,42天均進(jìn)行mNSS評(píng)分,兩組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均沒有顯著差異(P>0.05)。兩組比較結(jié)果見表1。
表1 各組大鼠間mNSS評(píng)分結(jié)果
2.2Limbplacement功能評(píng)分的結(jié)果
實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在各個(gè)時(shí)間的Limb placement評(píng)分沒有顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見表2。
表2 兩組大鼠間limbplacement評(píng)分結(jié)果
2.3Cornertest評(píng)分結(jié)果
兩組大鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的Corner test功能評(píng)分沒有顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見表3。
表3 兩組大鼠間的Corner test評(píng)分結(jié)果
2.4Nissl染色
Nissl染色正常腦組織為淺紫色,梗死區(qū)顏色發(fā)白。如圖1,2。結(jié)果用Image J軟件計(jì)算梗死體積和對(duì)側(cè)大腦半球的體積的百分比表示。通過t檢驗(yàn),兩組之間梗死體積百分比沒有顯著差異(P>0.05),結(jié)果如表4。
表4 兩組大鼠梗死體積百分比的結(jié)果
圖1 對(duì)照組Nissl染色的結(jié)果
圖2 hBMSCs治療組Nissl染色的結(jié)果
在世界范圍內(nèi),腦卒中是導(dǎo)致長(zhǎng)期殘疾的主要原因。目前,尚沒有太多有效的方法來促進(jìn)卒中后患者的神經(jīng)功能康復(fù)。近年來,細(xì)胞移植為腦卒中患者的治療帶來了新的希望。尤其是BMSCs。它們能夠識(shí)別并趨附腦損傷部位,一旦到達(dá)損傷部位,能夠分泌促進(jìn)腦組織恢復(fù)的因子[6]。此外,它們具有低免疫源性,能夠自體移植而不涉及倫理學(xué)問題。大量研究表明,BMSCs能夠改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能[7-9]。
BMSCs移植的最佳時(shí)間取決于腦梗死后周邊環(huán)境的動(dòng)力學(xué)改變。大多數(shù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,細(xì)胞移植的時(shí)間多為腦缺血后24小時(shí)或更短的時(shí)間[7-9]。但在實(shí)際的臨床病人中,由于倫理學(xué)及免疫源性等原因,多采用自體BMSCs治療。急性期患者的不良狀態(tài)以及BMSCs的較長(zhǎng)的培養(yǎng)周期為急性期的細(xì)胞治療提供了阻礙。卒中病人的細(xì)胞治療更可能在亞急性期或慢性期進(jìn)行。亞急性期細(xì)胞移植的效果目前尚沒有統(tǒng)一的定論。王利平等[3]認(rèn)為,亞急性期(造模后7天)給予BMSCs能夠減少微環(huán)境對(duì)宿遷細(xì)胞的損害,從而減小梗死體積,改善神經(jīng)功能。Bhimashankar Mitkaria等認(rèn)為亞急性期(造模后7天)給予MSCs雖然能促進(jìn)血管再生[10],但是并不能帶來神經(jīng)功能的好轉(zhuǎn)[10-12]。但是,也有研究[13,14]表明,造模后7天給予BMSCs能顯著的改善大鼠的運(yùn)動(dòng)和感覺功能。目前關(guān)于缺血再灌注后14天給予BMSCs治療報(bào)道較少。為了探索這一時(shí)期靜脈注射BMSCs對(duì)腦缺血大鼠的影響,本實(shí)驗(yàn)在MCAO后第14天給予hBMSCs治療,并用了三組行為功能測(cè)試來評(píng)估MCAO大鼠的運(yùn)動(dòng)、感覺的改善。這三個(gè)檢查分別是mNSS評(píng)分,limbplacement評(píng)分和Corner test評(píng)分。我們選這三種行為功能檢測(cè)方法是因?yàn)樗鼈儗?duì)腦梗死大鼠的感覺和運(yùn)動(dòng)損傷比較敏感[4,5],而且比較適用于長(zhǎng)期的觀察評(píng)估[5],不易受反復(fù)測(cè)試的影響。結(jié)果表明,造模14天給予hBMSCs靜脈治療后,一直到第42天并未見到治療組大鼠的神經(jīng)功能的改善。同時(shí),通過Nissl染色對(duì)兩組大鼠的梗死體積進(jìn)行對(duì)比,也沒有見到明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這說明,腦梗死后14天后給予靜脈注射hBMSCs并不能改善實(shí)驗(yàn)大鼠的神經(jīng)功能。這與其他部分亞急性期和慢性期治療的研究結(jié)果是不一致的[7,15]。應(yīng)該注意的是,在很多研究[7,16]中,BMSCs注射后的幾天內(nèi)很快就能看到行為功能的改善,這種改善更多的是與急性期神經(jīng)保護(hù)作用或者水腫以及炎癥反應(yīng)的減退有關(guān),而不是單純的感覺和運(yùn)動(dòng)的修復(fù)。除了治療的時(shí)間對(duì)治療效果的影響外,靜脈給予細(xì)胞的數(shù)量也是很重要的。通過對(duì)60項(xiàng)基礎(chǔ)研究的meta分析結(jié)果表明,注射的細(xì)胞數(shù)量和治療效果呈明顯的劑量相關(guān)性[17],增加細(xì)胞注射的數(shù)量有可能促進(jìn)神經(jīng)功能的改善。此外,盡管大多數(shù)的研究[18,19]認(rèn)為異體BMSCs沒有免疫排斥反應(yīng)或者很弱的免疫反應(yīng),目前尚缺乏自體和異體BMSCs在免疫反應(yīng)、動(dòng)力學(xué)改變以及治療效果方面的合適的對(duì)照研究。異體細(xì)胞的給入是否也影響了BMSCs治療的效果也需要進(jìn)一步的探索。
本研究證實(shí),亞急性期給予hBMSCs并不能改善腦梗死的神經(jīng)功能,其移植治療的時(shí)間窗需要更多的基礎(chǔ)研究來進(jìn)一步確定。