苑婷婷，儲成群，肖毅美，黃彬昌，李金燕

(深圳凱吉星農(nóng)產(chǎn)品檢測認(rèn)證有限公司，廣東 深圳 518000)

孔雀石綠( MG)為三苯甲烷類染料，曾被廣泛用于預(yù)防和治療各類水產(chǎn)動物的水霉病、鰓霉病和小瓜蟲病等[1]，亦會為了延長磷受損魚的生命用在運(yùn)輸過程或存放池內(nèi)等流通環(huán)節(jié)。但因其均具有潛在的致癌、致畸、致突變等副作用，嚴(yán)重威脅著消費(fèi)者的身體健康[2-3]。世界上許多國家已將孔雀石綠列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物，中國于2002年5月將孔雀石綠列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》(農(nóng)業(yè)部第193號公告)。由于孔雀石綠的藥物治療效果好且價格低廉，在水產(chǎn)養(yǎng)殖、流通中仍有部分養(yǎng)殖戶違法使用，是目前造成孔雀石綠在水產(chǎn)中檢出率居高不下的原因之一。

目前孔雀石綠主流檢測方法是高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)，檢出低限分別為0.5μg/kg和2.0μg/kg，日本和香港對孔雀石綠的不合格判定標(biāo)準(zhǔn)為2.0μg/kg。該技術(shù)除需配備昂貴的大型儀器和大量輔助實(shí)驗(yàn)設(shè)備外，前處理方法過于繁雜耗時，無法應(yīng)對水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)管發(fā)展需求。而發(fā)展較成熟免疫膠體金快速檢測技術(shù)因具有簡便快速等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于對產(chǎn)地和流通市場的樣品進(jìn)行常規(guī)篩選檢測[4]，卻也常被質(zhì)疑有如前處理復(fù)雜、假陽性率偏高、檢測靈敏度低等技術(shù)短板。

為客觀地分析和評價當(dāng)前國內(nèi)市場上此類(水產(chǎn)品孔雀石綠)免疫膠體金快速檢測試劑盒產(chǎn)品的質(zhì)量狀況，課題組選取5款主流的國產(chǎn)市售的可用于現(xiàn)場檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留的免疫膠體金快速檢測產(chǎn)品(簡稱孔雀石綠快檢試劑盒)進(jìn)行調(diào)研，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其靈敏度、穩(wěn)定性、實(shí)際樣品檢出符合率等技術(shù)指標(biāo)，為從事水產(chǎn)品中藥物殘留監(jiān)管的工作人員、水產(chǎn)品養(yǎng)殖和加工企業(yè)、農(nóng)批市場等流通領(lǐng)域應(yīng)用此類產(chǎn)品提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

表1 5款孔雀石綠快速檢測產(chǎn)品外觀及標(biāo)示情況比較

根據(jù)水產(chǎn)品孔雀石綠現(xiàn)場快速檢測的適用性需求，課題組基于檢測低限2.0μg/kg、無需大型的檢測儀器、單個樣品檢測2 h內(nèi)完成原則，篩選具有代表性的五家主流公司的產(chǎn)品進(jìn)行比較研究，為避免影響公司的經(jīng)營情況，本文將用A、B、C、D、E分別表示5款孔雀石綠快檢試劑盒，其基本情況見表 1。

1.2 試劑與設(shè)備

孔雀石綠、隱色孔雀石綠及其同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%，Dr.E)；乙腈、甲醇均為色譜純(J.T.Baker)，二氯甲烷、無水乙酸銨、冰乙酸等試劑均為分析純(上海國藥集團(tuán))。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國 AB 5500)、電子分析天平(Sartorius BT25S-CW)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 空白基質(zhì)樣品制備

選取不含孔雀石綠、隱性孔雀石綠殘留的草魚，去鱗、去皮，沿脊背取肌肉。樣品均質(zhì)混勻，18 ℃以下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 孔雀石綠快檢試劑盒的評判

采用各產(chǎn)品說明書中提供的檢測方法進(jìn)行檢測，試驗(yàn)中采用空白草魚樣品中對各產(chǎn)品進(jìn)行靈敏度、重復(fù)性、準(zhǔn)確性等加標(biāo)試驗(yàn)，依據(jù)GB/T 19857-2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》方法對快檢陽性樣品進(jìn)行符合性驗(yàn)證。

1.3.2.1 靈敏度試驗(yàn)

采用空白草魚樣品對標(biāo)稱檢測限、2倍標(biāo)稱檢測限、4倍檢測限和10倍檢測限進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，分別添加有孔雀石綠和隱性孔雀石綠標(biāo)樣，每個濃度做三次平行，并與空白樣品進(jìn)行對照。

1.3.2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

各試劑盒提供的產(chǎn)品在靈敏度試驗(yàn)時不一致，故根據(jù)各試劑盒的實(shí)際靈敏度進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。采用空白草魚樣品添加無色孔雀石綠標(biāo)樣，按照說明書的操作步驟，用同一產(chǎn)品在同一時間測定3個檢測試劑卡，判定產(chǎn)品的重復(fù)性。

1.3.2.3 對比性試驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證試劑的準(zhǔn)確性，聯(lián)系廠家技術(shù)人員現(xiàn)場對比試驗(yàn)，分別同時做10個不同濃度盲樣。

1.3.2.4 確性試驗(yàn)

為了驗(yàn)證試劑的準(zhǔn)確性，選取15 批次孔雀石綠快檢試劑盒判定為陽性樣品進(jìn)行上液質(zhì)定量驗(yàn)證其準(zhǔn)確性情況。

1.3.2.5 結(jié)果判讀

檢測結(jié)果為陰性、陽性和可疑結(jié)果(臨界區(qū)間)3種,檢測人員依照各孔雀石綠快檢試劑盒說明書中描述的“結(jié)果判讀原則”判定,并進(jìn)行結(jié)果讀取和記錄。根據(jù)最終結(jié)果計(jì)算各孔雀石綠快檢試劑盒的檢出符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈敏度

按照各孔雀石綠快檢試劑盒提供的說明書的操作步驟，以靈敏度試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)，按各試劑盒給定的判定方法進(jìn)行結(jié)果判定，在三個平行樣品必須一致，試驗(yàn)結(jié)果如表2。

表2 孔雀石綠試劑盒靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

注：“-”為陰性，未檢出；“+”為陽性，能進(jìn)行判定，有檢出；“+/-”因顏色顯現(xiàn)不明顯，定義為臨界區(qū)間可疑結(jié)果。

靈敏度方面，D、E試劑盒基本滿足(隱性)孔雀石綠檢測低限為2.0 μg/kg，但D試劑盒與標(biāo)稱檢測低限1.0 μg/kg不符；而C試劑盒隱性孔雀石綠檢測低限無法達(dá)到2.0 μg/kg，與標(biāo)稱不符；A、B試劑盒靈敏度驗(yàn)證存在較大偏差，檢測低限在10.0μg/kg，與標(biāo)稱嚴(yán)重不符。

2.2 穩(wěn)定性

由于各試劑盒檢出限不同，將準(zhǔn)確性試驗(yàn)中的檢出限結(jié)果作為重復(fù)性試驗(yàn)的濃度，采用空白草魚樣品添加隱形孔雀石綠標(biāo)樣至相應(yīng)的濃度，按照說明書的操作步驟用同一批次產(chǎn)品在同一時間測定3個樣品，按照要求判定檢測結(jié)果，具體如表3。

注： “-”為陰性，未檢出； “+”為陽性，能進(jìn)行判定，有檢出， “+/-”因顏色顯現(xiàn)不明顯，定義為臨界區(qū)間可疑結(jié)果。

穩(wěn)定性方面，除A試劑盒穩(wěn)定性較差外，其余4款試劑盒均表現(xiàn)良好。

2.3 對比性

為更客觀真實(shí)體現(xiàn)試劑盒技術(shù)性能，故從取樣到結(jié)果判定均由各試劑盒廠家技術(shù)人員獨(dú)立開展。鑒于A、B兩款試劑盒在加標(biāo)濃度為5.0μg/kg情況下無法準(zhǔn)確辨識，故不參與對比性試驗(yàn)。其余結(jié)果如表4。

表4 孔雀石綠試劑盒符合性試驗(yàn)結(jié)果

注： “-”為陰性，未檢出； “+”為陽性，能進(jìn)行判定，有檢出； “+/-”因顏色顯現(xiàn)不明顯，定義為臨界區(qū)間可疑結(jié)果。

由上述試驗(yàn)結(jié)果可知，3款試劑盒最多達(dá)到50%概率的符合性。而E試劑盒的假陽性率明顯高于另外兩家。

2.4 準(zhǔn)確性

隨機(jī)篩選15批次已知定量檢測結(jié)果的樣品，分別應(yīng)用這5款試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步對其準(zhǔn)確性及符合率進(jìn)行評估，結(jié)果如表5所示。

表5 快檢陽性樣品定量檢出符合率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

注：“符合”代表快檢結(jié)果與定量結(jié)果一致， “不符合”代表快檢結(jié)果與定量結(jié)果不一致。

2.5 評價分析

通過從靈敏度、重復(fù)性、對比性、準(zhǔn)確性四方面對這5款孔雀石綠快速檢測試劑盒技術(shù)性能進(jìn)行判定，匯總結(jié)果見表6。

表6 5款孔雀石綠試劑盒性能分析對比

注：“符合率”= 定量陽性數(shù)/快檢陽性數(shù)*100%。

通過從最低檢出限、檢測時間、檢出率和符合率系列數(shù)據(jù)進(jìn)行測評，5款試劑盒均具有操作步驟相對簡單，試劑種類精簡，便于檢測人員掌握等優(yōu)勢。但有3款靈敏度及定量結(jié)果符合性整體評價較差，D、E兩款試劑盒技術(shù)性能勉強(qiáng)符合現(xiàn)場檢測要求。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)存在一定比例的假陽性、假陰性結(jié)果，在目標(biāo)物含量偏低時，其陽性結(jié)果顯示存在一定的誤差，不易辨別。推測其可能原因是試劑本身含有的抗原或抗體特異性較差，易受生物體其他成分干擾形成假陽性或假陰性結(jié)果。

3 討論

作為水產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)監(jiān)控的孔雀石綠項(xiàng)目，其快速檢測試劑盒已成為一種現(xiàn)場快速檢測的監(jiān)管手段。而其質(zhì)量將直接影響監(jiān)管的權(quán)威性和有效性[5]。劉歡等[6]曾對10種孔雀石綠快檢產(chǎn)品進(jìn)行比較研究，有7種產(chǎn)品的檢測性能與其自身商標(biāo)標(biāo)識不符，產(chǎn)品不達(dá)標(biāo)。錢蓓蕾等[7]曾對3種孔雀石綠快速檢測試劑盒進(jìn)行比較研究，結(jié)果顯示有2種產(chǎn)品的檢測限沒有達(dá)到產(chǎn)品標(biāo)識要求。伏慧明等[8]發(fā)現(xiàn)應(yīng)用快速檢測試劑盒類產(chǎn)品得出的檢測結(jié)果往往與試劑盒所標(biāo)示的各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)相差甚遠(yuǎn)，出現(xiàn)假陽性的幾率很大，嚴(yán)重影響檢測方法的運(yùn)用和結(jié)果的判定，如在實(shí)際監(jiān)管中應(yīng)用該產(chǎn)品進(jìn)行檢測，將可能檢出大量的假陽性樣品，增加監(jiān)管部門使用儀器驗(yàn)證檢測結(jié)果的負(fù)擔(dān),影響監(jiān)管效率。依據(jù)文中試驗(yàn)情況分析，說明大部分基于免疫膠體金技術(shù)開發(fā)的孔雀石綠快檢產(chǎn)品的靈敏度還不能達(dá)到準(zhǔn)確定性、精確定量?？兹甘G快速檢測試劑盒市場確實(shí)存在相對混亂，產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊的現(xiàn)象。建議在應(yīng)用免疫膠體金類快速檢測試劑盒進(jìn)行水產(chǎn)品孔雀石綠殘留檢測前,有必要對試劑盒所標(biāo)示的各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)(如靈敏度、重復(fù)性、對比性、準(zhǔn)確性等)進(jìn)行逐一地驗(yàn)證，從而正確評估試劑盒技術(shù)性能及應(yīng)用風(fēng)險。