李德坤，余錦強(qiáng)，邵 杰，汪 艷，劉珍凱，周貴春，穆迎濤

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院 眼科·十堰市人民醫(yī)院 眼科中心，湖北 十堰442000)

沙眼感染性致盲的主要因素之一。隨著衛(wèi)生條件的改善，目前發(fā)達(dá)國(guó)家及地區(qū)沙眼的發(fā)病率已經(jīng)非常低，但是在我國(guó)以及亞州、非州和拉丁美洲等一些落后地區(qū)沙眼患者的數(shù)量依舊仍舊居高不下[1,2]。沙眼的病原菌是沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis，Ct)，Ct是一種具有獨(dú)特二相發(fā)育周期、細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭陰性細(xì)菌[3,4]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)A、B和C等血清型Ct極其容易感染眼部，從而導(dǎo)致沙眼，D-K型容易感染泌尿生殖道，導(dǎo)致尿道炎、盆腔炎和陰道炎等疾病，開(kāi)展Ct的致病機(jī)制研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[5]。

已有研究證實(shí)Ct的質(zhì)粒蛋白、熱休克蛋白、主要外膜蛋白，和III型分泌蛋白等多種蛋白都可能參與了致病過(guò)程[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)Ct與其他革蘭陰性細(xì)菌一樣，其外膜也含有大量的糖脂(Lipopolysaccharide，LPS)和脂蛋白。LPS一般是由脂質(zhì)A、O-抗原和核心區(qū)所組成。LPS具有活化補(bǔ)體和刺激機(jī)體釋放血管活性物質(zhì)等作用，在細(xì)菌的粘附和侵襲過(guò)程中起重要功能[9,10]。細(xì)菌LPS的合成途徑十分復(fù)雜，如大腸桿菌能利用LpxA(UDP-N-acetylglucosamine acyltransferase，LpxA)蛋白催化O-?；尤氲侥蜍?′-二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖，這個(gè)催化反應(yīng)是脂質(zhì)A合成途徑的第一步[11]。目前衣原體LPS的合成途徑尚缺乏研究，我們?cè)谇捌跀U(kuò)增得到Ct LpxA基因。本文擬通過(guò)基因工程的方法純化得到His-LpxA蛋白，然后將其免疫新西蘭兔，獲得了抗His-LpxA蛋白的血清，為進(jìn)一步研究Ct LPS的合成途徑提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1菌種、載體和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

大腸桿菌DH5α、BL21、含LpxA基因的重組質(zhì)粒pMD18-LpxA，原核表達(dá)載體pET28a都由湖北醫(yī)藥學(xué)院保存，實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物新西蘭兔購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2主要試劑和儀器

膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒、ExTaq酶、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ和T4 DNA連接酶及均購(gòu)自大連Takara公司，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京百泰克公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購(gòu)自美國(guó) Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc公司，ECL發(fā)光劑購(gòu)自英國(guó)Amersham，弗氏佐劑購(gòu)自Sigma公司產(chǎn)品。Ni2+層析凝膠購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；冷凍高速離心機(jī)(Microfuge 20R)購(gòu)自美國(guó)貝克爾曼；超聲波破碎儀(scientz-950E)購(gòu)自寧波新芝、超低溫冰箱和PCR儀購(gòu)自賽默飛世爾公司；半干電轉(zhuǎn)印儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)LpxA基因序列，使用primer primer6軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物序列為：5′-CCCATATGACCAACATTCATCCTACA-3′(下劃線為NdeⅠ酶切位點(diǎn))和下游引物序列為：LpxA-R:5′-TTCTCGAGTTACTAAGACTCAACGAAAGCTCCT- 3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。

1.4LpxA基因的擴(kuò)增及回收

以重組質(zhì)粒pMD18-LpxA為PCR模板，擴(kuò)增目的基因，PCR程序?yàn)椋?4 ℃，5 min；(94 ℃，30 s，58 ℃，30 s，72 ℃，1 min)* 35個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min，然后用瓊脂糖凝膠電泳將PCR產(chǎn)物電泳，回收目的DNA片段。

1.5重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將pET28a空質(zhì)粒和LpxA基因進(jìn)行雙酶切，回收。然后使用T4 DNA連接酶將LpxA和pET28a在16 ℃下過(guò)夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，37 ℃倒置，培養(yǎng)16 h。挑取陽(yáng)性單菌落到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，提取質(zhì)粒使用PCR驗(yàn)證，將PCR呈陽(yáng)性的細(xì)菌送上海生工公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.6重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將pET28a-LpxA轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21。第二天挑陽(yáng)性菌接種到LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，然后將其按照1∶100擴(kuò)接到新LB液體培養(yǎng)基；當(dāng)細(xì)菌長(zhǎng)到OD600約為0.6時(shí)，加入0.1 mmol/L IPTG到培養(yǎng)液，置于28 ℃培養(yǎng)，誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)重組His-LpxA蛋白，培養(yǎng)4 h后收集細(xì)菌。利用pH值為7.4的PBS溶液洗滌，然后在冰上進(jìn)行超聲破碎。使用12 000 r/min離心20 min，取上清加入Ni2+層析凝膠，孵育1 h，然后使用40 mmol/L咪唑洗脫雜蛋白，最后用250 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白并收集，使用SDS-PAGE檢測(cè)純化效果。

1.7兔抗His-LpxA蛋白多抗的制備

將純化好的His-LpxA蛋白與完全弗氏佐劑乳化，背部皮下多點(diǎn)注射接種新西蘭兔，每只兔接種200 μg，接種3只。三星期后，將His-LpxA蛋白與弗氏不完全佐劑乳化，然后每只兔背部皮下接種200 μg，進(jìn)行第二次免疫。第三，四次免疫方法和步驟與第二次相同。同時(shí)設(shè)置注射生理鹽水組為陰性對(duì)照。最后一次免疫2個(gè)星期后心臟處死采血，分離血清并將其保存在-20 ℃冰箱備用。

1.8抗血清的特異性和效價(jià)檢測(cè)

取純化好的His-LpxA進(jìn)行 SDS-PAGE凝膠電泳，然后以100 V恒電壓將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后，加入致備好的抗血清，4 ℃孵育過(guò)夜，洗滌干凈。加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，洗滌干凈后加入加底物進(jìn)行顯色，顯影后觀察結(jié)果。

將150 ng的His-LpxA蛋白包被到96孔板，4 ℃包被過(guò)夜。加入封閉液封閉2 h。將血清進(jìn)行1∶40，1∶80，1∶160，1∶320……1∶40 960倍比稀釋，然后每孔加入100 μl，以未免疫血清為陰性對(duì)照，同時(shí)設(shè)置PBS溶液為空白對(duì)照。室溫孵育2 h，洗滌干凈后加入1∶1000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG，室溫孵育反應(yīng)2 h。加入顯色劑顯色，10 min后加入終止液終止反應(yīng)，并測(cè)定其OD450，計(jì)算血清效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1表達(dá)載體的構(gòu)建

以pMD18-LpxA為PCR為模板，PCR擴(kuò)增得到的Ct LpxA基因大小為840 bp(圖1A)，與理論大小相符。將其連接到pET28a載體獲得重組質(zhì)粒pET28a-LpxA，使用PCR檢測(cè)pET28a-LpxA，也得到與LpxA基因理論分子量大小相同的條帶(圖1B)。測(cè)序結(jié)果顯示其序列與LpxA基因一致，表明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-LpxA。

注:M:Marker; 1,2:LpxA基因擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2His-LpxA蛋白的表達(dá)及純化

將重組質(zhì)粒pET28a-LpxA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌BL21，培養(yǎng)后使用0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)His-LpxA融合蛋白表達(dá)。電泳后發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，重組菌在32.8kDa左右有蛋白表達(dá)，與His-LpxA蛋白的理論分子量一致(圖2，泳道2)。經(jīng)Ni2+層析柱純化得到LpxA蛋白，其純度約為95%(圖2，泳道3)。

注：M：蛋白marker；1：轉(zhuǎn)化pET28a的誘導(dǎo)產(chǎn)物；2：重組菌BL21/ pET28a-LpxA 的誘導(dǎo)產(chǎn)物：3：經(jīng)Ni2+層析柱純化后的His-LpxA蛋白

2.3制備的多克隆抗體可識(shí)別His-LpxA蛋白如圖3所示，制備的多克隆抗體能夠識(shí)別重組His-LpxA蛋白。

圖3 制備的多克隆抗體能識(shí)別His-LpxA蛋白

2.4LpxA抗血清效價(jià)如圖4所示，使用ELISA測(cè)定對(duì)照組和免疫組新西蘭兔血清多克隆抗體的滴度，4次免疫后，將實(shí)驗(yàn)組血清血清稀釋10 240倍后為陽(yáng)性(圖4)，表明獲得血清的滴度大于1∶10 240，成功制備抗血清。

圖4 ELISA檢測(cè)LpxA蛋白免疫新西蘭兔后血清

3 討論

LPS是革蘭陰性細(xì)菌的毒力因子之一，對(duì)大多數(shù)的革蘭陰性細(xì)菌的活性極為重要，研究發(fā)現(xiàn)革蘭陰性細(xì)菌中至少有6個(gè)基因參與了脂質(zhì)A的合成，抑制其中任一基因的活性都會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌的死亡[9]。Ct感染能夠?qū)е律逞酆蜕车赖榷喾N疾病 近年來(lái)研究證實(shí)LPS是Ct的EB發(fā)育過(guò)程中必不可少的成分，如果抑制Ct脂質(zhì)A合成酶的活性，阻止Ct合成LPS，會(huì)導(dǎo)致具有感染活性的EB會(huì)失去感染能力[10,12]。LpxA基因是催化合成脂質(zhì)A的第一個(gè)關(guān)鍵基因，它能夠?qū)-?；D(zhuǎn)移到尿苷5'-二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖。現(xiàn)在針對(duì)細(xì)菌的LpxA蛋白開(kāi)發(fā)新型抗生素，LpxA蛋白有望成為控制Ct傳染的靶點(diǎn)之一[11,13,14]。

獲得高純度的LpxA蛋白為研究Ct中脂質(zhì)A合成途徑提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。His標(biāo)簽具有分子量小，免疫原性低和與Ni2+親和力高等特點(diǎn)，現(xiàn)在廣泛用于純化外源融合蛋白[15]。本研究將LpxA基因連接到pET28質(zhì)粒，得到的重組質(zhì)粒能夠表達(dá)含His標(biāo)簽的融合蛋白。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌大腸桿菌BL21，使用IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)融合蛋白，然后我們?cè)儆肗i2+親和法對(duì)純化目的蛋白，得到較好純度的融合蛋白。我們使用純化得到的融合蛋白免疫新西蘭兔，得到抗LpxA蛋白的血清，發(fā)現(xiàn)其效價(jià)高都于1∶10 240，說(shuō)明純化得到的融合蛋白能夠誘導(dǎo)新西蘭兔產(chǎn)生高效價(jià)的抗體，為進(jìn)一步研究LpxA蛋白功能提供基礎(chǔ)。