劉 洋

(青海省第五人民醫(yī)院(青海省腫瘤醫(yī)院)，青海 西寧810007)

大腸癌包括結(jié)腸癌和直腸癌，是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康的惡性腫瘤。目前，大腸癌已成為世界第三大常見(jiàn)腫瘤，西方發(fā)達(dá)國(guó)家的大腸癌病死率居全部惡性腫瘤第二位，在我國(guó)居第四位。Wnt信號(hào)通路異常是大腸癌發(fā)生發(fā)展的早期改變，在這個(gè)改變過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞不同與正常環(huán)境而生長(zhǎng)、增殖，同時(shí)腫瘤細(xì)胞的凋亡數(shù)量也減少[1]。作為Wnt信號(hào)通路中至關(guān)重要的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，SFRPs可能在大腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有重大的意義[2,3]。本研究采用PCR與凝膠電泳的方法測(cè)定大腸癌患者SFRP2基因的甲基化狀況，分析結(jié)果并探討其是否有望成為大腸癌篩查的重要指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2016年1月至2016年12月于我院就診的大腸癌患者40例，患者的檢查結(jié)果已通過(guò)病理檢查確診，病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者診斷為單一部位腫瘤；(2)患者診斷為首次確診，非復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移；(3)標(biāo)本采集前未行藥物治療和其他可能影響結(jié)果的腸道檢查。大腸癌患者作為觀察組，以健康志愿者作為對(duì)照組。大腸癌患者40人，其中男24人，女16人，年齡62-75歲，平均年齡69.03±5.12歲；健康志愿者40人，其中男25人，女15人，年齡62-74歲，平均年齡68.81±5.16歲。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組研究對(duì)象的一般情況，如年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有良好的可比性。

1.2方法

醫(yī)護(hù)人員指導(dǎo)患者和志愿者正確收集糞便標(biāo)本，標(biāo)本采集后由專人送至實(shí)驗(yàn)室，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要分裝后置于零下80℃的冰箱冰凍保存。

1.2.1DNA的提取與純化 采用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的糞便DNA基因組提取試劑盒，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作提取糞便DNA基因組，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取與純化得到的DNA片段的濃度與純度。

1.2.2DNA的亞硫酸氫鈉修飾 采用北京天漠科技開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)的DNA甲基化試劑盒，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，完成DNA的亞硫酸氫鈉修飾。

1.2.3PCR反應(yīng) 引物合成：采用針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物，由上海英拜生物科技有限公司合成，見(jiàn)表1。

表1 甲基化和非甲基化序列引物

PCR反應(yīng)條件：反應(yīng)體系：包括PCR緩沖液5 μl，2.5 mmol/LdNTP4 μl，甲基化上下游引物和非甲基化上下游引物各1 μl，甲基化模板DNA5 μl，Taq酶0.25 μl，加水至總體積50 μl。循環(huán)條件：先95℃預(yù)變性10 min，然后以95℃變性30 sec，55℃退火30 sec,72℃終末延伸60 sec的循環(huán)條件作35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

1.2.4瓊脂糖凝膠電泳 取擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)，瓊脂糖凝膠濃度2%，電壓75 V，45 min。

1.3觀察指標(biāo)查看瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)結(jié)果，以陽(yáng)性對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn)，出現(xiàn)陽(yáng)性條帶者為判斷為陽(yáng)性，統(tǒng)計(jì)并記錄陽(yáng)性例數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0對(duì)研究結(jié)果中的各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，定性資料采用卡方計(jì)數(shù)檢驗(yàn)法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05，以P<0.05作為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1大腸癌患者與健康志愿者糞便SFRP2基因甲基化的凝膠電泳結(jié)果對(duì)比:大腸癌患者糞便標(biāo)本可見(jiàn)SFRP2基因甲基化，幾乎所有健康志愿者糞便標(biāo)本未見(jiàn)SFRP2基因甲基化，見(jiàn)圖1。

圖1 大腸癌患者與健康志愿者糞便SFRP2基因甲基化的凝膠電泳結(jié)果

2.2大腸癌患者與健康志愿者糞便SFRP2基因甲基化例數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:大腸癌患者中出現(xiàn)甲基化的比率為80.00%(32/40)，健康志愿者出現(xiàn)甲基化的比率為7.5%(3/40)。與健康志愿者相比，大腸癌患者中出現(xiàn)甲基化的比率大大升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組對(duì)象糞便標(biāo)本甲基化情況比較

3 討論

近年來(lái)，在世界多數(shù)國(guó)家，大腸癌的發(fā)病率逐漸上升。大腸癌早期無(wú)癥狀或癥狀不明顯，癌瘤生長(zhǎng)速度緩慢，在其達(dá)到機(jī)體出現(xiàn)明顯癥狀、體征之前要經(jīng)過(guò)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，故臨床前來(lái)就診的患者往往癌腫已到晚期[4,5]。早期診斷對(duì)于提高大腸癌患者生存率以及改善大腸癌患者生活質(zhì)量至關(guān)重要。目前臨床常用的檢測(cè)手段為大腸內(nèi)鏡檢測(cè)、鋇餐造影等檢查，但是這些傳統(tǒng)檢測(cè)因檢查過(guò)程繁瑣、有創(chuàng)、費(fèi)時(shí)等因素而不適合推廣使用。臨床常用的篩查方法還包括大便隱血試驗(yàn)和癌胚抗原(CEA)檢測(cè)等，這些篩查方法雖然無(wú)創(chuàng)，但是敏感性以及特異性較差，臨床應(yīng)用價(jià)值不高[6]。因此，全球癌癥工作者都著手于尋求一種更新的大腸癌檢測(cè)手段，能具有簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)、可靠等優(yōu)點(diǎn)。由于具備諸多優(yōu)點(diǎn)，糞便DNA檢測(cè)已逐漸成為近年來(lái)各個(gè)國(guó)家癌癥工作者檢測(cè)大腸癌研究的熱點(diǎn)[7]。

近期的研究顯示，表觀遺傳學(xué)改變，尤其是DNA甲基化的改變?cè)诖竽c癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用，DNA甲基化變化被認(rèn)為是結(jié)直腸癌發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵機(jī)制。人類(lèi)有五種sFRP基因，分別為sFRP1基因、sFRP2基因、sFRP3基因、sFRP4基因、sFRP5基因，其中sFRP2基因作為作為Wnt信號(hào)通路中至關(guān)重要的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，通過(guò)使基因沉默的作用，其甲基化改變成為大腸癌一個(gè)重要特征。在人體發(fā)育的過(guò)程中，Wnt信號(hào)通路主要在細(xì)胞的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)和分化過(guò)程中發(fā)揮作用，器官和組織成熟后，Wnt信號(hào)通路也有助于其內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。Wnt信號(hào)通路異常是大腸癌發(fā)生發(fā)展的早期改變，在這個(gè)改變過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞不同與正常環(huán)境而生長(zhǎng)、增殖，同時(shí)腫瘤細(xì)胞的凋亡數(shù)量也減少。分泌型卷曲相關(guān)蛋白是Wnt信號(hào)通路的拮抗物，其含有一個(gè)特有的半胱氨酸富含域(CRD)，同Wnt信號(hào)的FZ型受體的CRD同源。SFRPs可以使Wnt信號(hào)通路受阻，可能的途徑為：(1)與Wnt信號(hào)蛋白質(zhì)相互競(jìng)爭(zhēng)以阻止它們與FZ型蛋白結(jié)合；(2)與FZ型受體形成無(wú)功能的復(fù)合物，減少FZ型受體復(fù)合物對(duì)機(jī)體的實(shí)際作用。SREPs基因甲基化后，阻礙作用下調(diào)，Wnt信號(hào)通路激活，持續(xù)作用于大腸癌發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程，腫瘤細(xì)胞不斷生長(zhǎng)、增殖。因此，作為Wnt信號(hào)通路中至關(guān)重要的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，SFRPs可能在大腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有重大的意義。

糞便DNA檢測(cè)是近年來(lái)全球大腸癌檢測(cè)研究的熱點(diǎn)方向。正常腸道黏膜細(xì)胞在生長(zhǎng)、增殖的同時(shí)，也有大量細(xì)胞更新脫落進(jìn)入腸腔，隨著糞便排出體外。這提示，在糞便可能存在與癌癥和癌癥細(xì)胞相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)和基因。而癌細(xì)胞的增殖代謝相較于正常腸道粘膜細(xì)胞更加旺盛，只要使用DNA提取技術(shù)將糞便中的DNA提取出來(lái)，使用PCR擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增相關(guān)突變基因，在采用凝膠電泳方法分析產(chǎn)物，就可能達(dá)到通過(guò)糞便診斷大腸癌的目的[8,9]。本研究分析了大腸癌患者糞便樣本中SFRP2甲基化狀態(tài)。結(jié)果表明，大腸癌患者中出現(xiàn)甲基化的比率為80.00%(32/40)，健康志愿者出現(xiàn)甲基化的比率為7.50%(3/40)。與健康志愿者相比，大腸癌患者中出現(xiàn)甲基化的比率大大升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本研究采用亞硫酸鹽處理基因組DNA使其發(fā)生甲基化狀態(tài)依賴的序列改變，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增待檢測(cè)的DNA區(qū)域。擴(kuò)增片段中原先未被甲基化的胞嘧啶位點(diǎn)上發(fā)生胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏さ母淖?，而原先被甲基化的胞嘧啶位點(diǎn)則保持不變。與其他甲基化檢測(cè)技術(shù)比較，具有以下特點(diǎn)[10,11]：(1)檢測(cè)靈敏度高，樣品消耗少，僅需1 μg的基因組DNA。(2)檢測(cè)結(jié)果更為直觀。(3)可定量檢測(cè)靶位點(diǎn)甲基化水平。(4)結(jié)果可信，出現(xiàn)假陽(yáng)性的概率很小。

綜上所述，SFRP2基因的甲基化改變是篩選大腸癌的敏感標(biāo)志，糞便SFRP2基因甲基化檢測(cè)有望成為無(wú)創(chuàng)診斷大腸癌的新途徑。