張 彬，翟蒙恩，李凱峰，李步瀠，劉振華，陳正希，江麗青，梁宏亮，段維勛，金振曉，俞世強(qiáng)

隨著發(fā)病率逐年攀升，缺血性心臟病嚴(yán)重威脅著人類健康［1］，主因冠脈血流供應(yīng)減少，導(dǎo)致心肌細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，影響心臟正常的能量代謝。目前，隨著急診溶栓、急診冠脈介入治療和冠狀動(dòng)脈旁路移植手術(shù)等缺血再灌注技術(shù)的廣泛應(yīng)用，部分急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者能得到及時(shí)的再灌注治療。然而，在恢復(fù)血流供應(yīng)后，缺血心肌組織損傷在某些情況下反而進(jìn)一步加重，導(dǎo)致大量心肌細(xì)胞死亡，嚴(yán)重影響心臟功能及其預(yù)后，這種現(xiàn)象被稱為心肌缺血再灌注損傷（my?ocardial ischemia reperfusion injury， MI／RI）［2－3］。 深入研究MI／RI發(fā)病機(jī)理，探索保護(hù)心肌的新靶點(diǎn)及藥物是目前心血管保護(hù)領(lǐng)域亟待解決的問題。

褪黑素（Melatonin，Mel）是一種由松果體分泌的吲哚類激素，具有改善睡眠、抗免疫、抗衰老和抗腫瘤等廣泛的生物學(xué)效應(yīng)［4］。許多研究證實(shí)，褪黑素在高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、MI／RI、心肌肥厚等多種心血管疾病中發(fā)揮重要的保護(hù)作用［5］。同時(shí)，有研究報(bào)道衰老標(biāo)記蛋白30（senescence marker pro?tein－30，SMP30）作為一種新型鈣結(jié)合蛋白，參與調(diào)節(jié)體內(nèi)細(xì)胞增殖及多種生理代謝過程，近年來也發(fā)現(xiàn)其在抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗凋亡等細(xì)胞保護(hù)作用中扮演重要角色［6－7］，但其是否介導(dǎo) Mel抗 MI／RI 尚不清楚。為此，本研究采用H9c2細(xì)胞模擬缺血再灌注（simulated ischemia reperfusion，SIR）損傷模型，深入探究Mel減輕MI／RI新機(jī)制，為今后Mel用于缺血性心肌病及其并發(fā)癥的治療提供新的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 主要材料和實(shí)驗(yàn)方法

1．1 細(xì)胞株及主要試劑 H9c2細(xì)胞（ScienCell公司，美國）；Mel，超氧化物陰離子熒光探針（二氫乙錠，dihydroethidium，DHE）（Sigma－Aldrich公司，美國）；鈣離子熒光探針（Fluo－4 AM）（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）（南京建成生物工程研究所）；CCK－8細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（上海七海復(fù)泰生物科技有限公司）；anti－SMP30 和 anti－gp91phox抗體（Santa Cruz公司，美國）；anti－Bcl2、anti－Bax、anti－cleaved caspase 3 抗體（Cell Signaling公司，美國）；anti－β－actin 抗體（CMCTAG公司，美國）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠和驢抗羊IgG二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1．2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 滅菌型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Ther?mo）；激光掃描共聚焦顯微鏡和倒置顯微鏡（Olym?pus）；高速低溫離心機(jī)（Eppendorf）；Western blot電泳、轉(zhuǎn)膜及凝膠成像設(shè)備（Bio－Rad）；酶標(biāo)儀（Spec?traMax）。

1．3 H9c2細(xì)胞培養(yǎng)及SIR模型的建立 H9c2培養(yǎng)用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。SIR通過使用缺血液培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)：待各組細(xì)胞貼壁并生長(zhǎng)到一定密度后，棄掉培養(yǎng)液，加入缺血液（含 CaCl2·2H2O 0．9 mmol／L、MgCl20．49 mmol／L、NaCl 137 mmol／L、KCl 12 mmol／L、4－羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES） 4 mmol／L、脫氧葡萄糖 10 mmol／L、連二亞硫酸鈉 0．75 mmol／L、乳酸鈉 20 mmol／L，pH 值調(diào)至 6．5）避光置于 37℃，5%CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)45 min，模擬缺血過程結(jié)束后更換正常培養(yǎng)液在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h完成再灌注。

1．4 SMP30 siRNA 的轉(zhuǎn)染 將 H9c2 細(xì)胞按 1．0×106／孔接種于6孔板上，貼壁生長(zhǎng)24 h，待細(xì)胞密度達(dá)50%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染操作按lipofectamine 3000試劑說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前4 h吸凈含血清的普通培養(yǎng)液，換成2 ml不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基（dulbec?co＇s modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)液。 轉(zhuǎn)染結(jié)束后繼續(xù)進(jìn)行相應(yīng)給藥及SIR處理。實(shí)驗(yàn)分組如下：①Con：對(duì)照組；②SIR組；③Mel＋SIR組：藥物預(yù)處理加SIR損傷組；④siSMP30＋Mel＋SIR組：抑制SMP30表達(dá)后，再進(jìn)行藥物處理及SIR組；⑤ siSMP30＋SIR組：?jiǎn)渭円种芐MP30表達(dá)后，進(jìn)行SIR損傷組。

1．5 DHE熒光探針檢測(cè)活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量 待各組細(xì)胞處理結(jié)束后，吸凈培養(yǎng)液，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗3 次，加入含有 DHE 染液（5 μmol／L）的無血清培養(yǎng)液避光在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育30 min，進(jìn)行熒光探針裝載，隨后用無血清的培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，立即用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔外直徑（outside diameter，OD）值（535 nm波長(zhǎng)下吸光度值）指示細(xì)胞內(nèi)ROS含量。

1．6 Fluo－4 AM 熒光探針檢測(cè)胞內(nèi) Ca2＋濃度 Ca2＋熒光探針Fluo－4 AM負(fù)載細(xì)胞時(shí)需用無Ca2＋培養(yǎng)液（NaCl 135 mmol／L、KCl 2 mmol／L、MgCl22 mmol／L、HEPES 10 mmol／L、葡萄糖 4 g／L）稀釋成工作濃度5 μmol／L。 待各組細(xì)胞處理結(jié)束后，吸凈培養(yǎng)液，用PBS漂洗3次，向細(xì)胞中加入Fluo－4 AM工作液，避光37℃孵育30 min。棄去熒光探針，更換新的無Ca2＋培養(yǎng)液，避光37℃繼續(xù)孵育30 min。以酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔 OD值（Ex／Em：494／506 nm 波長(zhǎng)下吸光度值）指示細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度。

1．7 細(xì)胞活力檢測(cè) 將H9c2細(xì)胞接種在96孔板上，待各組細(xì)胞處理結(jié)束后，向每孔內(nèi)加入10 μl的CCK－8反應(yīng)液，避光在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值（450 nm波長(zhǎng)下吸光度值）指示細(xì)胞活力。

1．8 Western blot檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平 收集處理結(jié)束后的各組細(xì)胞，加入裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑混合物，置于冰上充分裂解，并對(duì)細(xì)胞裂解上清進(jìn)行蛋白定量。各組蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺變性凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylam?ide gel electrophoresis， SDS－PAGE）分離，并用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF膜）上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，分別孵育在 SMP30（1 ∶500）、gp91phox（1 ∶500）、β 細(xì)胞淋巴瘤／白血病基因 2（B－cell lymphoma， Bcl2）（1 ∶1 000）、Bcl2相關(guān) X 蛋白（Bcl2－Associated X，Bax）（1 ∶1 000）、裂解半胱天冬酶 3（cleaved caspase 3）（1 ∶1 000）、β－肌動(dòng)蛋白（β－actin）（1 ∶4 000）抗體中4℃過夜。洗膜緩沖液（tris Buffered saline with tween，TBST）洗脫3次，加入對(duì)應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠和驢抗羊IgG二抗，室溫孵育2 h，TBST洗脫3次，通過Bio－Rad照相系統(tǒng)采集照片，用ImageLab軟件對(duì)其進(jìn)行分析，以β－actin作為內(nèi)參，分別檢測(cè)各蛋白表達(dá)情況。

1．9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析（ANOVA），若總體差異顯著，再以t檢驗(yàn)分析相應(yīng)兩組間的顯著性差異。以P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 Mel呈劑量依賴性的減輕H9c2細(xì)胞SIR損傷

與Con組相比，SIR處理后H9c2細(xì)胞的存活率顯著降低（P＜0．05）；Mel預(yù)處理可提高 SIR損傷后H9c2細(xì)胞的存活率，其中 Mel濃度為 100 μmol／L作用效果最明顯（P＜0．05）。同時(shí)，與Con組相比，SIR損傷顯著上調(diào)了凋亡蛋白cleaved caspase 3和氧化應(yīng)激標(biāo)志蛋白 gp91phox的表達(dá)（P＜0．05）；Mel預(yù)處理可抑制SIR損傷后H9c2細(xì)胞凋亡蛋白cleaved caspase 3和氧化應(yīng)激標(biāo)志蛋白gp91phox的表達(dá)，其中Mel濃度為100 μmol／L時(shí)作用效果最明顯（P＜0．05），后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采取此濃度進(jìn)行藥物預(yù)處理。見圖1A～D。

2．2 Mel可顯著增強(qiáng)SIR損傷后SMP30蛋白的表達(dá)，減輕細(xì)胞鈣超載 首先筆者檢驗(yàn)了siRNA的干擾效率，發(fā)現(xiàn) SMP30 siRNA可以顯著降低細(xì)胞SMP30蛋白的表達(dá)，但對(duì)細(xì)胞凋亡通路無明顯影響，除外了siRNA本身對(duì)細(xì)胞的影響（圖2A～C）。與Con組相比，SIR損傷后H9c2細(xì)胞SMP30蛋白表達(dá)量顯著降低，細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度顯著升高，經(jīng)Mel預(yù)處理可呈劑量依賴性的提高SMP30的表達(dá)量，降低 Ca2＋濃度，且 Mel濃度為 100 μmol／L 時(shí)作用效果最明顯（P＜0．05）；免疫熒光染色也發(fā)現(xiàn) Mel預(yù)處理可顯著提高SMP30的表達(dá)，用SMP30 siRNA抑制SMP30分子的表達(dá)后，可逆轉(zhuǎn)Mel的上述作用（P＜0．05）。 見圖 1E～F；圖 2D～G。

圖1 不同濃度Mel（μmol／L）對(duì)SIR損傷后細(xì)胞的保護(hù)作用及胞內(nèi)Ca2＋濃度及SMP30表達(dá)量的影響

圖2 SMP30 siRNA抑制SMP30表達(dá)后對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度及SMP30表達(dá)量的影響

2．3 SMP30介導(dǎo)Mel抗凋亡作用減輕H9c2細(xì)胞SIR損傷 抑制SMP30蛋白表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，與Mel＋SIR組相比，siSMP30＋Mel＋SIR組細(xì)胞皺縮明顯增多，脫落增加，細(xì)胞活力明顯下降；同時(shí)細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl2表達(dá)顯著下降，凋亡蛋白Bax、cleaved caspase 3表達(dá)顯著增加（P＜0．05）。與SIR組相比，siSMP30＋SIR 組細(xì)胞形態(tài)和 Bcl2、Bax、cleaved caspase 3蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0．05）。見圖3。

2．4 SMP30介導(dǎo)Mel抗氧化應(yīng)激作用減輕H9c2細(xì)胞SIR損傷 抑制SMP30蛋白表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，與Mel＋SIR組比，siSMP30＋Mel＋SIR組細(xì)胞中SOD活性顯著降低，MDA含量、ROS生成量及gp91phox表達(dá)量均顯著增加（P＜0．05）。 與 SIR 組比，siSMP30＋SIR 組對(duì)H9c2細(xì)胞中MDA含量、SOD活性、ROS生成量、gp91phox表達(dá)量均沒有顯著影響（P＞0．05）。 見圖4。

3 討 論

本研究通過離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)，Mel預(yù)處理可激活SMP30信號(hào)，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力，減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載，進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡和壞死，最終改善心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為完善Mel在MI／RI中的保護(hù)作用提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

近年來，缺血性心臟病嚴(yán)重地威脅著人群健康，其治療核心是重新恢復(fù)缺血心肌的血液供應(yīng)。然而通過對(duì)先前缺血心肌實(shí)行血流恢復(fù)后，在某種情況下又會(huì)加重再灌注損傷癥狀，包括心肌細(xì)胞功能異常和細(xì)胞死亡。MI／RI形成是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過程，其發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚。有大量文獻(xiàn)顯示MI／RI的發(fā)生可能與細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧自由基的產(chǎn)生、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、能量代謝障礙、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙及心肌細(xì)胞凋亡等因素密切相關(guān)［8－10］。而氧化應(yīng)激和鈣超載是其中兩個(gè)重要的損傷因素，尋找減輕氧化應(yīng)激和鈣超載的有效措施來改善MI／RI顯得尤為重要。

心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2＋主要儲(chǔ)存于肌漿網(wǎng)和線粒體內(nèi)，并且靜息狀態(tài)下胞漿內(nèi)游離Ca2＋濃度很低。心肌細(xì)胞缺血后，無氧代謝使組織間液和細(xì)胞內(nèi)pH下降，激活 Na＋通道、Na＋／H＋交換體和 Na＋／HCO3－同向轉(zhuǎn)運(yùn)體，胞內(nèi)Na＋濃度增加；同時(shí)，缺血期細(xì)胞線粒體受損，導(dǎo)致能量供應(yīng)障礙，Na＋－K＋－ATP酶活性降低，也造成胞內(nèi)Na＋濃度增加。再灌注時(shí)，膜上反向鈉鈣交換體（Na＋／Ca2＋exchanger，NCX） 被廣泛激活，導(dǎo)致胞外Ca2＋大量、快速進(jìn)入心肌細(xì)胞，加之細(xì)胞膜通透性增加，再灌注時(shí)Ca2＋順著濃度梯度大量?jī)?nèi)流，最終形成胞內(nèi)鈣超載［11－12］。 以往研究發(fā)現(xiàn)，SMP30在細(xì)胞調(diào)控中扮演多種角色，能夠維持機(jī)體多種細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)。并且有報(bào)道稱，在SMP30高表達(dá)的肝細(xì)胞內(nèi)，SMP30可能通過調(diào)控胞膜Ca2＋泵，增強(qiáng)胞內(nèi) Ca2＋外流進(jìn)而減輕細(xì)胞損傷［13］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，在 SIR損傷后，細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度顯著升高，Mel預(yù)處理可顯著促進(jìn)SMP30的表達(dá)，繼而降低胞內(nèi)Ca2＋濃度，減輕細(xì)胞損傷；然而，用SMP30 siRNA抑制SMP30表達(dá)可逆轉(zhuǎn)Mel的保護(hù)作用，表明Mel可能通過激活SMP30信號(hào)，減輕胞內(nèi)鈣超載，進(jìn)而改善細(xì)胞缺血再灌注損傷。

圖3 SMP30 siRNA抑制SMP30表達(dá)后對(duì)相關(guān)蛋白凋亡指標(biāo)的影響

圖4 SMP30 siRNA抑制SMP30表達(dá)后對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響

氧化應(yīng)激與MI／RI的關(guān)系近年來也被大量的研究證實(shí)。當(dāng)心肌細(xì)胞缺血、缺氧時(shí)，ROS清除系統(tǒng)功能降低，生成系統(tǒng)活性增強(qiáng)，一旦恢復(fù)組織血液供應(yīng)和氧供，ROS反而會(huì)進(jìn)一步產(chǎn)生并急劇堆積，以不同方式造成細(xì)胞急性或慢性損傷［14－15］。 Mel作為內(nèi)源性的吲哚類激素，具有強(qiáng)效抗氧化應(yīng)激作用，在腸、肝臟、心臟、腦等多種器官的缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮保護(hù)性作用［16－19］，其作用機(jī)制包括清除自由基、降低一氧化氮合酶和一氧化氮生成、保護(hù)線粒體功能、抑制細(xì)胞凋亡等。此外，作為一種衰老相關(guān)蛋白，SMP30會(huì)隨著機(jī)體的衰老在多種組織器官中表達(dá)量逐漸下降。除了在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)中扮演重要角色，SMP30的抗氧化作用也在多種動(dòng)物模型和細(xì)胞系中得到驗(yàn)證［7，20］，并且能夠通過抑制一氧化氮合酶、蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性以及促進(jìn)Bcl2、Akt的表達(dá)來減輕細(xì)胞凋亡［21］。 然而，SMP30能否介導(dǎo)Mel的抗氧化應(yīng)激與凋亡的作用未見報(bào)道，在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷后，細(xì)胞活力下降，SMP30蛋白表達(dá)量下調(diào)，凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，氧化應(yīng)激水平上升。Mel預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng)的發(fā)生，發(fā)揮減輕缺血再灌注損傷的作用，而Mel的抗氧化應(yīng)激與抗凋亡作用均可被SMP30 siRNA抵消，進(jìn)一步驗(yàn)證了SMP30可介導(dǎo)Mel對(duì)H9c2細(xì)胞的保護(hù)作用。

綜上所述，SMP30分子可作為Mel新的作用靶點(diǎn)，來介導(dǎo)其發(fā)揮減輕MI／RI的作用。