柴國祥 韓斌孝 孫建軍 章國平 楊永紅 王磊 牛晨霞 李興芳 徐英春

我國是結(jié)核病高發(fā)的國家之一, 對(duì)結(jié)核病的防治與治療是一項(xiàng)長期的研究工作［1］。而近年來, 新耐藥結(jié)核的出現(xiàn),結(jié)核病的防治又出現(xiàn)了新挑戰(zhàn)［2］。因此, 對(duì)于結(jié)核病的診斷能力加強(qiáng)也是當(dāng)前結(jié)核病控制的一個(gè)重點(diǎn)。對(duì)結(jié)核病的檢查中, 細(xì)菌學(xué)的檢查是作為該病診斷的金標(biāo)準(zhǔn), 傳統(tǒng)檢查應(yīng)用的抗酸染色涂片的檢查敏感性較低僅為9%~35%, 分枝桿菌的復(fù)合群快速培養(yǎng)平均報(bào)陽較低, 也難滿足臨床上對(duì)結(jié)核病的快速診斷需求［3,4］。因此, 本研究通過采用RNA實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù), 對(duì)疑似為結(jié)核病的患者痰樣本進(jìn)行檢測分析, 結(jié)果對(duì)比痰菌培養(yǎng)及痰涂片檢查結(jié)果, 研究取得一定成果, 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取本院2016年2月~2018年2月收治的疑似肺結(jié)核病患者400例作為研究對(duì)象, 其中男243例, 女157例；年齡13~78歲, 平均年齡(43.47±11.51)歲；400例疑似肺結(jié)核病患者中依據(jù)《肺結(jié)核和治療指南》的診斷結(jié)果為肺結(jié)核的患者183例, 依據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、結(jié)合病理學(xué)分析、痰涂片與培養(yǎng)等診斷為其他肺部疾病患者217例。

1. 2 方法

1. 2. 1 痰抗酸桿菌涂片與痰分枝桿菌的培養(yǎng) 選擇BACTEC MGIT 960快速培養(yǎng)法對(duì)患者痰樣本采集、分離與預(yù)處理, 并對(duì)痰分枝桿菌分別進(jìn)行涂片與培養(yǎng)。

1. 2. 2 樣本處理 400例疑似肺結(jié)核病患者通過RNA實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)進(jìn)行檢測。RNA實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測試劑盒(上海仁度生物技術(shù)有限公司, 批號(hào)：20130407)。痰樣本采集、分離與預(yù)處理。取得待測標(biāo)本11400×g高轉(zhuǎn)速離心機(jī)下進(jìn)行離心5 min, 并除去上清液；后加入1 ml的生理鹽水進(jìn)行洗滌, 再次除去上清液；并加入濃度為50 μl的人淋巴毒素β(LTB)稀釋液進(jìn)行重懸,超聲處理15 min, 11400×g高轉(zhuǎn)速離心機(jī)下重復(fù)進(jìn)行離心5 min, 備用。

1. 2. 3 擴(kuò)增檢測 取2 μl的處理物加入到30 μl的擴(kuò)增檢測液當(dāng)中。檢測前對(duì)微量反應(yīng)管進(jìn)行恒溫預(yù)熱, 在60℃溫度下預(yù)熱10 min后, 轉(zhuǎn)至42℃溫度下進(jìn)行預(yù)熱5 min；同時(shí)對(duì)實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增酶液進(jìn)行預(yù)熱至溫度達(dá)到42℃。預(yù)熱結(jié)束后, 對(duì)每支反應(yīng)管單獨(dú)加入10 μl的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增酶液, 并進(jìn)行充分混勻, 反應(yīng)管同時(shí)快速轉(zhuǎn)到熒光定量PCR儀(7500 FAST, 美國ABI)當(dāng)中。熒光定量PCR儀反應(yīng)程序熒光通道設(shè)定FAM, 42℃下、1 min, 進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；熒光信號(hào)收集以1 min 1次。H37Ra菌株為陽性對(duì)照, 以無菌水為陰性對(duì)照。

1. 3 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) 以樣本的曲線與閾值的曲線產(chǎn)生的交叉點(diǎn)橫坐標(biāo)讀數(shù), 即樣本檢測時(shí)間為DT, 當(dāng)DT≤35 min則檢測為陽性；當(dāng)DT >40 min則檢測為陰性；其中中間讀數(shù)以重新檢測, 并記錄復(fù)測值。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 檢測結(jié)果分析 以臨床診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn), RNA實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測出結(jié)核病患者陽性133例, 涂陽患者61例, 涂陰72例, 敏感度為72.68%, 特異度為98.62%。實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的符合率為86.75%, 顯著高于痰分枝桿菌的培養(yǎng)(69.75%)和痰抗酸桿菌涂片(67.50%), 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(P＜0.05)。其中實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的3例非陰性陽性, 涂片均為陽性。見表1。

2. 2 不同肺結(jié)核患者的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測結(jié)果 183例診斷結(jié)果為肺結(jié)核的患者中, 涂陽培陽患者實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測檢出率為100.00%, 涂陰培陽患者檢出率為78.95%, 涂陰培陰患者檢出率為56.00%, 涂陽培陰患者檢出率為40.00%。見表2。

表1 肺結(jié)核檢測結(jié)果(n)

表2 不同肺結(jié)核患者的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測結(jié)果(n, %)

3 討論

肺結(jié)核作為高發(fā)病率的疾病, 其發(fā)現(xiàn)率卻僅在40%左右。對(duì)于結(jié)核患者進(jìn)行快速的診斷是結(jié)核防控項(xiàng)目的一個(gè)重點(diǎn), 以往常規(guī)檢測方法往往很難達(dá)到快速診斷的效果［5］。而在近年來, 隨著技術(shù)的改進(jìn), 熒光定量PCR技術(shù)逐漸應(yīng)用到肺結(jié)核的檢驗(yàn)當(dāng)中, 該技術(shù)能快速、高效的進(jìn)行診斷。本研究采用RNA實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù), 其檢測優(yōu)點(diǎn)在于能夠直接的以結(jié)核分枝桿菌的特異性RNA作為擴(kuò)增的靶標(biāo), 并以擴(kuò)增的產(chǎn)物RNA作為檢測的靶標(biāo), 因?yàn)镽NA僅在活菌當(dāng)中才能存在, 在結(jié)核分枝桿菌死亡后, RNA會(huì)降解。因此, 該方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)活動(dòng)性的肺結(jié)核及該病的治療效果監(jiān)測。通過400例疑似結(jié)核痰樣本研究結(jié)果顯示, 以臨床診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn), RNA實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測出結(jié)核病患者陽性133例, 涂陽患者61例, 涂陰72例, 敏感度為72.68%, 特異度為98.62%。實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的符合率為86.75%, 顯著高于痰分枝桿菌的培養(yǎng)(69.75%)和痰抗酸桿菌涂片(67.50%), 對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中RNA實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測的3例非陰性陽性, 涂片均為陽性。183例診斷結(jié)果為肺結(jié)核的患者中, 涂陽培陽患者RNA實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測檢出率為100.00%, 涂陰培陽患者檢出率為78.95%, 涂陰培陰患者檢出率為56.00%,涂陽培陰患者檢出率為40.00%。研究結(jié)果均顯示RNA實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測能有效的對(duì)結(jié)核病進(jìn)行檢測。

綜上所述, RNA實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)對(duì)檢測肺結(jié)核病具快速、便捷、經(jīng)濟(jì)和高敏感度等特點(diǎn), 該方法值得在臨床的結(jié)核篩查中進(jìn)行應(yīng)用。