王恒禹，董艷萍

(1. 云南省藥物研究所，云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心，云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111； 2. 昆藥集團(tuán)股份有限公司藥物研究院，云南 昆明 650100)

全世界只有中國(guó)產(chǎn)三七，而中國(guó)三七的主產(chǎn)地在云南。為改變長(zhǎng)期以來(lái)三七花、三七莖葉不能作為普通食品原料進(jìn)行開發(fā)利用的現(xiàn)狀，2016年5月13日，云南省衛(wèi)生計(jì)生委正式批復(fù)同意將三七花和三七莖葉作為普通地方特色食品原料進(jìn)行管理[1]。

鐘媛媛等[2]研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的三七多糖能夠增強(qiáng)小鼠的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力、提高體內(nèi)抗體生成細(xì)胞數(shù)和抗體積數(shù)、提高腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞的吞噬率及吞噬指數(shù)，對(duì)小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫均有一定的促進(jìn)作用。三七總皂苷具有增強(qiáng)免疫力的功能，能顯著提高巨噬細(xì)胞吞噬率，提高血液中淋巴細(xì)胞的百分比[3]。據(jù)測(cè)定，三七花同樣也含有多糖、皂苷、黃酮、鳥苷腺苷、β-谷甾醇、胡蘿卜素等成分[4]。本文通過(guò)測(cè)定三七花提取物對(duì)自然殺傷(NK)細(xì)胞活性的影響，進(jìn)而研究三七花提取物的免疫調(diào)節(jié)功能以求更好地利用三七花資源。

NK細(xì)胞由造血干細(xì)胞分化發(fā)育而來(lái)，成熟的NK細(xì)胞主要分布于肝、脾和外周血中，NK細(xì)胞是具有細(xì)胞溶解作用、能夠分泌免疫調(diào)節(jié)因子的效應(yīng)淋巴細(xì)胞，它與T/B淋巴細(xì)胞不同，NK細(xì)胞同時(shí)具有固有免疫和適應(yīng)免疫的特征，在免疫系統(tǒng)中具有重要作用[5]。本文通過(guò)水提、過(guò)濾、濃縮、凍干等工藝獲得了三七花提取物[6]，研究了三七花水提物對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響，可為三七花在功能食品領(lǐng)域中的應(yīng)用提供理論支持。

1 理論支撐

在正常生理狀況下，細(xì)胞內(nèi)的乳酸脫氫酶(LDH)不能穿過(guò)細(xì)胞膜，但當(dāng)細(xì)胞受到NK細(xì)胞的殺傷而裂解后，LDH釋放到細(xì)胞膜外的培養(yǎng)基上清中。釋放出來(lái)的LDH可通過(guò)酶試劑盒檢測(cè)。在酶反應(yīng)中LDH可使一種四唑鹽(INT)轉(zhuǎn)化為紅色的甲臜(formazan)。甲臜的量與LDH的濃度亦即裂解的細(xì)胞數(shù)成正比，通過(guò)測(cè)定吸光度值可以直觀地反映出上清液中的甲臜含量[7]。吸光度越高說(shuō)明上清液中的甲臜含量越高，酶反應(yīng)之前的LDH濃度也越高，裂解的細(xì)胞數(shù)越多，NK細(xì)胞的活性越強(qiáng)；相反，吸光度值越低，說(shuō)明上清液中的甲臜含量較低，酶反應(yīng)之前的LDH濃度也較低，裂解的細(xì)胞數(shù)越少，對(duì)應(yīng)的NK細(xì)胞活性也較低。NK細(xì)胞活性的變化與吸光度的變化呈線性關(guān)系，因此可以通過(guò)檢測(cè)吸光度值，通過(guò)比較試驗(yàn)組吸光度值與空白對(duì)照組吸光度值計(jì)算出NK細(xì)胞的相對(duì)活性。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 材料

三七花，昆明道地中藥飲片廠；雌性Balb/c小鼠，18～22 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(圓底)，上海基星生物科技有限公司；無(wú)菌鋁箔封板膜，北京博特森生物技術(shù)有限公司；小鼠淋巴瘤細(xì)胞(YAC-1)，上海研生實(shí)業(yè)有限公司；D-Hanks平衡鹽緩沖液(HBSS)，上海研卉生物科技有限公司；RPMI 1640完全培養(yǎng)液，上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；重組人白細(xì)胞介素-2(rhIL-2)，廣州市博理生物科技有限公司；CytoTox 96?非放射性細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；Gey’s紅細(xì)胞裂解液，北京百奧萊博科技有限公司。

2.2 三七花提取物的制備

取藥材三七花1 kg，分3次分別加水10 、8、8 L加熱提取，每次提取2 h，提取溫度為90 ℃，3次提取液過(guò)濾后合并，濃縮至1 L左右，經(jīng)離心除去沉淀物，上清液經(jīng)冷凍干燥獲得三七花提取物。

2.3 檢測(cè)

2.3.1 提取物的成分分析

分別參照2015版《中國(guó)藥典》中人參總皂苷的測(cè)定方法[8]以及《保健食品功效成分檢測(cè)方法》(2002版)中“可溶性粗多糖測(cè)定方法”測(cè)定所得樣品的總皂苷及可溶性多糖的含量。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)分組

試驗(yàn)設(shè)62.5、125、250、500和1 000 μg/mL 5個(gè)劑量組和1個(gè)空白對(duì)照組，作用時(shí)間設(shè)6 h和24 h 2組。

2.3.3 靶細(xì)胞液的制備

試驗(yàn)前24 h將YAC-1細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，試驗(yàn)開始前用HBSS液洗滌靶細(xì)胞2次，再用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104個(gè)/孔。

2.3.4 效應(yīng)細(xì)胞液的制備

效應(yīng)細(xì)胞液為脾細(xì)胞懸液，在無(wú)菌環(huán)境下摘取小鼠脾臟，在盛有適量無(wú)菌HBSS液的小皿中用鑷子將脾臟磨碎；組織液經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾后再以1 500 r/min離心5 min收集沉淀；沉淀部分用Gey’s紅細(xì)胞裂解液混懸，2 min后用預(yù)冷的HBSS清洗沉淀物3次；沉淀細(xì)胞用RPMI1640完全培養(yǎng)液(含500 ng/mL rhIL-2)培養(yǎng)3 d，試驗(yàn)開始前再將細(xì)胞濃度稀釋至1×105個(gè)/孔，獲得效應(yīng)細(xì)胞懸液[9]。

2.3.5 受試樣品制備

試驗(yàn)開始前，在潔凈實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密稱取三七花提取物凍干粉(經(jīng)輻照滅菌)，以RPMI1640完全培養(yǎng)液溶解后經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾，以培養(yǎng)液稀釋制備62.5、125、250、500和1 000 μg/mL等5個(gè)不同劑量的受試樣品溶液備用。

2.3.6 吸光度檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)設(shè)試驗(yàn)組、空白對(duì)照組、靶細(xì)胞自然釋放組和靶細(xì)胞最大釋放組(完全裂解)。試驗(yàn)組為細(xì)胞液中添加不同濃度三七花提取物的樣本組；空白對(duì)照組為細(xì)胞液中添加等量不含三七花提取物的空白溶劑(培養(yǎng)液)組；靶細(xì)胞自然釋放組為不添加任何物質(zhì)的NK細(xì)胞懸液；靶細(xì)胞最大釋放組為添加裂解液促使體系內(nèi)靶細(xì)胞完全裂解的樣品組。試驗(yàn)組中在96孔板內(nèi)分別加入50 μL不同濃度的受試品溶液，再分別加入50 μL靶細(xì)胞懸液效應(yīng)細(xì)胞懸液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37℃，5% CO2)孵育6 h和24 h。

孵育結(jié)束前45 min，在靶細(xì)胞最大釋放組內(nèi)加入15 μL裂解液(10×)，然后將圓底培養(yǎng)板以250 g的離心力離心4 min；從每孔吸取50 μL上清液轉(zhuǎn)移至新的96孔板中，再向新的96孔板每孔中加入50 μL反應(yīng)底物，用無(wú)菌鋁箔封板膜覆蓋板子使之避光，室溫孵育30 min后，每孔加入50 μL 終止液，于1 h內(nèi)測(cè)定吸光度值A(chǔ)490。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定

NK細(xì)胞的活性可通過(guò)以下公式計(jì)算獲得：

NK細(xì)胞活性=

NK細(xì)胞活性的比較采用空白組與試樣組各組間t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行顯著性分析；三七花提取物作用6和24 h后小鼠NK細(xì)胞活性變化的顯著性分析是在不添加三七花提取物，只在孵育結(jié)束前添加裂解液的情況下，小鼠NK細(xì)胞活性與空白組存在顯著性差異(p≤0.01)的條件下，以試樣組與空白組之間進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。當(dāng)NK細(xì)胞活性增強(qiáng)，且p≤0.01時(shí)，則判定為試樣品組的NK細(xì)胞活性顯著高于對(duì)照組的NK細(xì)胞活性，該試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，試樣對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性有增強(qiáng)效果。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

4.1 三七花提取物成分的檢測(cè)

經(jīng)檢測(cè)三七花提取物的可溶性多糖含量為75.48%，總皂苷含量為5.35%。

4.2 吸光度檢測(cè)數(shù)據(jù)

實(shí)驗(yàn)每組設(shè)6個(gè)平行，所測(cè)得的吸光度值如表1所示。

4.3 數(shù)據(jù)處理與分析

三七花提取物對(duì)NK細(xì)胞活性影響的試驗(yàn)中，NK細(xì)胞活性檢測(cè)的吸光度值及NK細(xì)胞活性的計(jì)算結(jié)果如表2所示。

表1 實(shí)驗(yàn)各組的吸光度值A(chǔ)490

表2 NK細(xì)胞活性檢測(cè)吸光度值和NK細(xì)胞活性 %

注：*：p<0.05，樣品組比空白組；**：p<0.01，樣品組比空白組。

圖1和圖2分別示出三七花提取物作用靶細(xì)胞6和12h后檢測(cè)的NK細(xì)胞活性。

圖1 三七花提取物對(duì)NK細(xì)胞活性的影響，作用時(shí)長(zhǎng)6h

圖2 三七花提取物對(duì)NK細(xì)胞活性的影響，作用時(shí)長(zhǎng)24h

由圖1、圖2可知：在三七花提取物的質(zhì)量濃度為62.5和125 μg/mL時(shí)，試樣組小鼠NK細(xì)胞的活性與空白對(duì)照組比較，作用時(shí)間為6 h的時(shí)候，試樣組的NK細(xì)胞活性略低于空白組(12.2±0.95%)，分別為10.53±1.33%和11.95±0.86%；作用時(shí)間為24 h時(shí)，2個(gè)濃度的試樣組小鼠NK細(xì)胞活性分別為26.78±3.02%和29.27±1.56，空白組為28.00±0.84%；小鼠NK細(xì)胞的活性均無(wú)顯著性差異。從圖1和圖2可以看出，在三七花提取物質(zhì)量濃度≥250 μg/mL時(shí)，作用6和24 h后，試樣組小鼠NK細(xì)胞的活性增強(qiáng)，與空白組比較存在顯著性差異，且隨著三七花提取物質(zhì)量濃度的提高，小鼠NK細(xì)胞的活性增強(qiáng)。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，三七花提取物質(zhì)量濃度高于250 μg/mL時(shí)，作用6和12 h后，試樣組的NK細(xì)胞活性均顯著高于對(duì)照組，三七花提取物具有一定的NK細(xì)胞活性增強(qiáng)作用。

5 討論

該實(shí)驗(yàn)以三七花為原料，經(jīng)水提、過(guò)濾、濃縮、凍干所獲得的三七花提取物，其多糖含量高達(dá)75.48%，總皂苷含量為5.35%，經(jīng)檢測(cè)該提取物在質(zhì)量濃度范圍為62.5～1 000 μg/mL內(nèi)對(duì)小鼠NK細(xì)胞的活性均有增強(qiáng)作用，且在質(zhì)量濃度高于250 μg/mL時(shí)，其增強(qiáng)作用更加明顯。NK細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中具有重要作用，在固有免疫效應(yīng)中，NK細(xì)胞能夠雙向調(diào)節(jié)T/B淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)；另外，O’Leary等[10]研究T/B細(xì)胞缺乏的小鼠半抗原引起的接觸性超敏反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞具有記憶性，之后Lopez-Verges等[11]研究發(fā)現(xiàn)該缺陷型小鼠接觸化學(xué)性半抗原一個(gè)月后將致敏小鼠的肝臟NK細(xì)胞移植至受體小鼠體內(nèi)，受體小鼠也可產(chǎn)生不依賴于T/B淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)，表明NK細(xì)胞具有適應(yīng)性免疫作用。

6 結(jié)論

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)，三七花提取物具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，能夠通過(guò)促進(jìn)NK細(xì)胞的活性進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，可用于具有增強(qiáng)免疫力功能的保健食品開發(fā)。在云南地區(qū)，三七花已被批準(zhǔn)作為地方特色食品原料進(jìn)行管理，可作為一般原料更廣泛地應(yīng)用于各類普通食品中。三七花提取物的提取工藝簡(jiǎn)單，對(duì)環(huán)境友好，不產(chǎn)生污染物。加強(qiáng)對(duì)三七花化學(xué)成分及生物學(xué)功能的研究，開展三七花資源深加工，對(duì)促進(jìn)地區(qū)產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義，對(duì)其他中草藥的開發(fā)利用也具有一定的參考價(jià)值。