張旭 章愛蓮 陳俊國 陸燕 王瓊 余煒杰 張世杰 滕懿群 吳鳴

細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3（suppressors of cytokine signaling 3，SOCS3）是 Janus 激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3（JAK/STAT3）信號通路的主要負(fù)性調(diào)控因子，其過度表達(dá)可抑制胰島素和瘦素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，對胰島素和瘦素抵抗的發(fā)生起重要作用[1-3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）大鼠體內(nèi)SOCS3基因表達(dá)上調(diào)[4]。因此，降低SOCS3基因的表達(dá)，可能減少對胰島素信號抑制，改善胰島素抵抗程度。RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是一種在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達(dá)的技術(shù)，具有簡單、特異及高效的特點(diǎn)[5]。慢病毒具有感染細(xì)胞效率高、表達(dá)持續(xù)穩(wěn)定的特點(diǎn)，是RNAi理想的載體[6]。本研究利用慢病毒介導(dǎo)RNAi技術(shù)，抑制T2DM大鼠肝臟和骨骼肌SOCS3基因表達(dá)，觀察血糖、胰島素、胰島素抵抗相關(guān)指數(shù)的變化，探討下調(diào)SOCS3基因?qū)2DM胰島素抵抗的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 5周齡健康雄性SD大鼠40只，體重180～220g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（滬）2012-0002。飼養(yǎng)環(huán)境為無特定病原體級（SPF）條件下，室溫 20～25℃、晝夜 12h交替環(huán)境中，2只/籠飼養(yǎng)，期間自由取食和飲水。

1.2 主要試劑 慢病毒載體質(zhì)粒（pGLV1/U6/GFP）、慢病毒包裝質(zhì)粒（pGag/Pol、pRev、pVSV-G）（上海吉瑪公司）；C6大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞（杭州赫貝公司）；DMEM培養(yǎng)液（美國Gibco公司）；鏈脲佐菌素（美國Sigma公司）；總RNA快速提取試劑盒（上海捷瑞公司）；熒光定量PCR試劑盒（北京天根公司）；葡萄糖測定試劑盒（上海榮盛公司）；胰島素酶聯(lián)免疫試劑盒（上海撫生公司）；羊抗SOCS3一抗、兔抗 β-actin一抗（美國Santa Cruz公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（美國Bioworld公司）。1.3 方法

1.3.1 SOCS3短發(fā)夾RNA（shRNA）的構(gòu)建 在 NCBI GenBank中檢索大鼠SOCS3基因核苷酸序列（Gene ID:89829），參考小干擾 RNA（siRNA）設(shè)計原則分別設(shè)計4條21個堿基的siRNA序列，利用BLAST檢索，確認(rèn)siRNA序列的特異性。同時，隨機(jī)設(shè)計1條同樣長度的非干擾序列siRNA-Negative作為對照。分別將設(shè)計的siRNA序列合成shRNA雙鏈DNA，以序列TTCAAGAGA作為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可以避免形成終止信號，并在3′端加入序列TTTTTT，可以終止轉(zhuǎn)錄。將shRNA雙鏈DNA克隆到慢病毒載體質(zhì)粒中，產(chǎn)生大鼠SOCS3 shRNA表達(dá)質(zhì)粒，分別命名為 shRNA-N、shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4。

1.3.2 SOCS3 shRNA干擾效率的檢測 SOCS3 shRNA表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定正確后轉(zhuǎn)染C6大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，48h后收集樣品，實時熒光定量PCR法和Western blot法檢測SOCS3 shRNA表達(dá)質(zhì)粒對靶基因的干擾效率，最終確定shRNA4干擾效率最高，序列5′-CACCTTCTCCGAACGTGTCACGTTATTCAAGAGATAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3′。

1.3.3 慢病毒的包裝與滴度測定 將干擾效率最高的SOCS3 shRNA表達(dá)質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)?；旌?，加入無血清DMEM中，室溫放置20min后，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6h后吸去轉(zhuǎn)染液，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，72h后收集含慢病毒顆粒的293T細(xì)胞上清液，0.45μm濾器過濾后，超速離心濃縮2h，將濃縮病毒液置于-70℃冰箱保存，同樣方法包裝非干擾序列慢病毒。293T細(xì)胞按3×104細(xì)胞/孔的濃度接種96孔板中培養(yǎng)24h。將慢病毒原液稀釋至5個梯度，每孔加入100μl稀釋的慢病毒液，培養(yǎng)24h，再加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液100μl，繼續(xù)培養(yǎng)72h后，通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)，計數(shù)熒光細(xì)胞，結(jié)合稀釋倍數(shù)測定慢病毒滴度為1.0×109TU/ml。

1.3.4 動物模型制備與實驗分組 40只大鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)。4周后，單次按30mg/kg腹腔注射1%鏈脲佐菌素。5d后連續(xù)3次測隨機(jī)血糖，血糖值＞16.7mmol/L者確定為T2DM大鼠模型，共30只大鼠造模成功，成模率75.0%。30只T2DM大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和干擾組各15只。對照組注射非干擾序列慢病毒1.5ml/次，干擾組注射SOCS3 RNAi慢病毒1.5ml/次。注射方式為尾靜脈注射，時間為實驗第1天和第15天，共2次。

1.3.5 標(biāo)本收集 4周后大鼠禁食12h，10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔內(nèi)注射，麻醉成功后開胸心臟取血5ml，離心后收集血清。采集肝臟和骨骼肌組織，用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液洗凈，于液氮冷凍后轉(zhuǎn)移至-70℃冰箱保存。

1.3.6 血清學(xué)檢測 采用ELISA法檢測空腹胰島素（FINS）含量，葡萄糖氧化酶法檢測空腹血糖（FPG）含量。胰島素抵抗指數(shù)（IRI）=（FPG×FINS）/22.5，表示大鼠的胰島素抵抗程度。胰島素敏感性指數(shù)（ISI）=ln（FPG×FINS）-1，表示大鼠對胰島素的敏感性。

1.3.7 實時熒光定量PCR法檢測SOCS3 mRNA表達(dá)水平 Trizol法提取肝臟和骨骼肌組織中總RNA，按試劑說明書,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在實時熒光定量PCR儀上行 PCR，PCR 反應(yīng)參數(shù)為：95℃ 10s，60℃ 20s，72℃30s,共 40個循環(huán)。SOCS3上游引物：5′-GGGGCCC－CTTCCTTTTCTTTA-3′，下游引物：5′-CGACAAAGATGCTGGAGGGT-3′；內(nèi)參 β-actin 上游引物：5′-CCCATCT ATGAGGG TTACGC-3′，下游引物：5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。 采 用 2－ΔΔct法 分 析SOCS3 mRNA的表達(dá)量。

1.3.8 Western blot法檢測SOCS3蛋白表達(dá)水平 提取肝臟和骨骼肌組織中總蛋白并測定濃度，按每泳道30μg蛋白上樣，蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜（PVDF）膜。將PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉封閉 1h 后，加入一抗 SOCS3（1∶500）和 β-actin（1∶500）室溫孵育 2h，洗膜后加入二抗 SOCS3（1∶5 000）和 β-actin（1∶5 000）室溫孵育 2h，再次洗膜后，加入化學(xué)發(fā)光試劑液，置凝膠成像儀中曝光顯影以及圖像分析。SOCS3蛋白表達(dá)水平以其與β-actin的比值表示。1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SOCS3 shRNA的基因沉默作用 以未受轉(zhuǎn)染SOCS3 shRNA的C6大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞為對照，該組細(xì)胞SOCS 3 mRNA和蛋白的表達(dá)量值定為1，計算其他各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞SOCS3 mRNA和蛋白的相對表達(dá)量，所有樣本重復(fù)3次，取平均值。實時熒光定量PCR法和Western blot法檢測結(jié)果顯示，4個質(zhì)粒干擾效率不同，其中shRNA4的干擾效率最高，可使SOCS3表達(dá)水平下調(diào)達(dá)70%，而shRNA1為25%，shRNA2為35%，shRNA3為50% ，見圖1-2。

圖1 C6大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中SOCS3蛋白表達(dá)電泳圖

圖2 各組細(xì)胞SOCS3 mRNA表達(dá)水平

2.2 兩組大鼠肝臟和骨骼肌組織中SOCS3 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較 干擾組肝臟和骨骼肌組織中SOCS3 mRNA和蛋白表達(dá)水平較對照組均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），表明T2DM大鼠注射SOCS3 RNAi慢病毒后，RNA特異性干擾SOCS3表達(dá)成功，見表1和圖3。

表1 兩組大鼠肝臟和骨骼肌組織中SOCS3 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

圖3 兩組大鼠肝臟和骨骼肌SOCS3蛋白表達(dá)電泳圖

2.3 兩組大鼠FINS、FPG、IRI和ISI比較 干擾組FINS、FPG和IRI較對照組均明顯下降，而ISI較對照組明顯上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），表明T2DM大鼠注射SOCS3 RNAi慢病毒后，胰島素敏感性明顯升高，胰島素抵抗得到了改善，見表2。

表2 兩組大鼠FINS、FPG、IRI和ISI比較

3 討論

胰島素抵抗是T2DM發(fā)病機(jī)制的核心[7]，SOCS3過度表達(dá)可能干擾胰島素的作用效果，導(dǎo)致胰島素抵抗[1-2]。肝臟和骨骼肌是胰島素抵抗的主要發(fā)生器官[8]，研究顯示，通過基因敲除技術(shù)使肝臟和骨骼肌SOCS3表達(dá)缺陷，可提高胰島素敏感性，改善胰島素抵抗[9-10]。因此，SOCS3可能成為治療T2DM的靶點(diǎn)，通過下調(diào)SOCS3基因的表達(dá)，可能減少對胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制，提高胰島素的生物學(xué)效應(yīng)，阻止T2DM的發(fā)生、發(fā)展。RNAi是siRNA誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)同源mRNA特異性降解所引起的基因沉默現(xiàn)象，慢病毒載體感染細(xì)胞效率高，免疫反應(yīng)小，可使目的基因整合到宿主染色體，實現(xiàn)長期穩(wěn)定的表達(dá)。本研究根據(jù)siRNA原則設(shè)計4條序列作為SOCS3基因干擾候選靶序列，并分別構(gòu)建4個SOCS3 shRNA表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染C6大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞篩選出干擾效率最高的質(zhì)粒，與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，產(chǎn)生滴度為1.0×109TU/ml的慢病毒顆粒。然后將其經(jīng)尾靜脈注射方式作用于肝臟和骨骼肌組織，實現(xiàn)干擾SOCS3表達(dá)的目的。結(jié)果顯示，干擾組大鼠肝臟、骨骼肌SOCS3 mRNA和蛋白水平降低至對照組的70%左右。這種通過RNAi下調(diào)基因表達(dá)，具有高度特異性和高效性，避免了基因敲除的不良反應(yīng)。T2DM大鼠肝臟和骨骼肌SOCS3被沉默后，F(xiàn)INS、FPG和IRI均明顯下降，而ISI明顯上升，提示下調(diào)SOCS3表達(dá)可有效地改善胰島素對葡萄糖代謝的作用，緩解胰島素抵抗的程度。本研究中，干擾效率最高的SOCS3 shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C6大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，可使SOCS3 mRNA和蛋白水平表達(dá)下調(diào)70%，但T2DM大鼠注射SOCS3 RNAi慢病毒后，SOCS3抑制率降低為30%，也稍低于通過下丘腦注射慢病毒的干擾效果[11]，考慮可能與注射方式、慢病毒滴度、機(jī)體代謝及內(nèi)環(huán)境有關(guān)。

綜上所述，以慢病毒為載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)可有效發(fā)揮基因沉默作用，通過抑制T2DM大鼠SOCS3的表達(dá)，可提高T2DM大鼠胰島素敏感性，緩解胰島素抵抗程度，可能成為治療糖尿病的新手段之一。