李文桔 王樂丹 趙宇

卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤之一，雖然發(fā)病率低于宮頸癌及子宮內(nèi)膜癌，但由于早期診斷困難，70%～80%的患者發(fā)現(xiàn)時已為中晚期，治療效果亦不理想，病死率已居婦科惡性腫瘤首位[1]。目前臨床上用于診斷及監(jiān)測卵巢癌及腫瘤治療后復發(fā)的腫瘤標志物主要為CA125，但50%～60%的Ⅰ期卵巢癌患者 CA125水平并未升高[2]。此外，CA125水平升高也見于月經(jīng)期、孕早期、子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢良性腫瘤或其他一些惡性腫瘤。因此，臨床上需要陽性預測值更高的腫瘤指標用于早期發(fā)現(xiàn)卵巢癌。目前由Smith等[3]創(chuàng)建的噬菌體展示技術被認為是篩選腫瘤細胞表面特異性結合肽的強有力、高通量的一種生物學技術[4]。該技術以噬菌體為載體，將外源基因插入噬菌體的基因組中，從而使其表達的外源多肽或蛋白與噬菌體衣殼蛋白以融合的形式展示在噬菌體表面，展示的外源多肽或蛋白并不影響噬菌體自身結構及功能，而且可以保持相對獨立的空間結構及生物學活性。本研究利用噬菌體隨機七肽庫篩選卵巢癌細胞HO-8910表面特異性結合肽，以期為卵巢癌的早期診斷提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料 卵巢癌細胞株HO-8910購自上海拜力生物科技有限公司，胰腺癌細胞株PANC-1和卵巢癌細胞株SKOV3均購自中國科學院上海細胞研究所細胞庫，文庫滴度為2×1013pfu/ml的噬菌體隨機七肽庫購自美國New England Biolabs公司，抗M13單抗和HRP-抗M13單抗均購自美國GE Healthcare公司。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體生物淘洗 消化、收集細胞株HO-8910，重懸于含1%牛血清白蛋白（BSA）的DMEM無血清培養(yǎng)液，調(diào)整細胞數(shù)為1×107/ml；加入噬菌體隨機七肽庫10μl于4℃共同孵育2h；將混懸液與事先配置的有機分離液200μl（鄰苯二甲酸二丁酯與環(huán)己烷組成，體積比為9∶1，密度為1.03g/ml)混合，低溫離心機10 000g離心10min；轉移EP管底的沉淀物至200μl的處于對數(shù)生長期的ER2738大腸桿菌菌液，細菌培養(yǎng)箱孵育30min，而后測滴度、擴增、純化，進入下一輪淘洗，計數(shù)每一輪淘洗后和擴增后的噬菌體數(shù)目，計算回收率，如此重復3個循環(huán)。

1.2.2 ELISA法檢測細胞株HO-8910與唑菌體單克隆的親和力 96孔板內(nèi)加入含104/孔的HO-8910細胞懸液，固定20min；封閉液（含1%BSA）封閉1h；分別加入在第3輪淘洗后獲得的21個噬菌體單克?。?.0×1010pfu/孔），設定PBS和M13K07為陰性對照，細菌培養(yǎng)箱里孵育 2h；加入 HRP-抗 M13 單抗（1∶6 000）共同孵育2h；TMB顯色液顯色，微板閱讀器設置在405nm，如果隨機克隆的OD值＞2.1倍的陰性對照克隆的OD值，即P/N值＞2.1，就表示此克隆對細胞有高親和力。

1.2.3 噬菌體DNA測序 根據(jù)ELISA結果，選取其中親和性較高的17個噬菌體，提取噬菌體DNA，通過基因序列推導出多肽序列，計算重復噬菌體數(shù)量。

1.2.4 噬菌體結合實驗 分別收集細胞數(shù)為1×107/ml的HO-8910、PANC-1、SKOV3細胞懸浮液；分別加入10μl噬菌體MRMTIIN與這3種細胞低溫孵育2h；離心、復蘇、測滴度，計算不同細胞噬菌體結合率（洗脫后的噬菌體滴度/淘洗加入噬菌體滴度）。

1.2.5 免疫細胞染色 分別將細胞株HO-8910、PANC-1、SKOV3以每孔1.0×104/ml接種于細胞爬片上，多聚甲醛固定15min；BSA封閉20min；分別加入噬菌體MRMTIIN和 M13K07噬菌體（1.0×1010pfu/孔），37℃共同孵育2h，PBS為陰性對照；滴加1∶100倍比稀釋的HRP-抗M13單抗孵育2h；將細胞爬片取出后置于載玻片上，在顯微鏡下滴加DAB顯色液觀察細胞顯色情況，后蘇木素染細胞核，脫水、透明、封片，顯微鏡下拍片存檔，細胞上有棕黃色顆粒提示陽性。

1.2.6 免疫熒光染色 分別將細胞株HO-8910、PANC-1、SKOV3接種于載玻片上，步驟同免疫細胞染色，加入1∶100倍比稀釋的抗M13抗體共同孵育2h；加入熒光標記的兔抗鼠IgG（1∶300）于37℃共同孵育0.5h；1∶5 000的DAPI染細胞核，熒光顯微鏡下立即觀察顯色情況。

1.2.7 競爭抑制實驗 不同稀釋梯度的多肽MRMTIIN或?qū)φ针腞MTIINM與HO-8910細胞懸液低溫孵育0.5h，再加入1.0×109pfu的噬菌體MRMTIIN低溫孵育2h；隨后步驟同噬菌體結合實驗，多肽濃度最高為500μmol/L，最低為 0.01μmol/L，以 10 倍比逐漸稀釋，總共有6個稀釋度，其中多肽濃度為0μmol/L時，噬菌體滴度為100%，實驗組共有7組，多肽濃度分別為0、0.01、0.1、1、10、100、500μmol/L，觀察相同濃度不同多肽的菌斑數(shù)量。

2 結果

2.1 陽性噬菌體的富集 本實驗利用噬菌體隨機七肽庫對卵巢癌HO-8910細胞進行全細胞篩選，計算每輪回收率。結果顯示第3輪回收率為4.6×10-4，與第1輪相比增加了306倍，由此提示噬菌體得到有效的富集，見表1。

表1 噬菌體七肽庫篩選卵巢癌細胞株表面特異性多肽

2.2 陽性噬菌體親和力鑒定 隨機挑選第3輪淘洗后平板中獲得的21個噬菌體單克隆進行ELISA實驗，結果顯示有17個噬菌體P/N值均＞2.1，見圖1。

圖1 ELISA法檢測細胞株HO-8910與噬菌體單克隆的親和力

2.3 DNA序列測定 選擇ELISA試驗中P/N值高的17個噬菌體單克隆進行DNA序列測定，結果顯示17個噬菌體單克隆中有9種不同噬菌體，其中展示Met-Arg-Met-Thr-Ile-Ile-Asn（MRMTIIN）序列的噬菌體有7個，出現(xiàn)頻率最高，見表2。

表2 噬菌體單克隆的序列分析及多肽序列

2.4 陽性噬菌體特異性鑒定

2.4.1 噬菌體結合實驗 噬菌體MRMTIIN與細胞株HO-8910結合率最高，提示噬菌體MRMTIIN與HO-8910有較高的親和力和特異性，見表3和圖2。

表3 噬菌體MRMTIIN與不同細胞的結合實驗

2.4.2 免疫細胞染色 HO-8910細胞表面可見棕黃色顆粒，說明噬菌體MRMTIIN能與HO-8910細胞結合（圖3a，見插頁），而PANC-1、SKOV3細胞表面未見棕黃色顆粒，說明噬菌體MRMTIIN不能與PANC-1細胞（圖3b，見插頁）和SKOV3細胞（圖3c，見插頁）結合；而對照組所有細胞均未見棕黃色顆粒，說明對照噬菌體M13K07均不與這3種細胞結合（圖3d-f，見插頁）。

圖2 噬菌體MRMTIIN與不同細胞的結合實驗

2.4.3 免疫熒光染色 HO-8910細胞表面可見綠色熒光提示噬菌體MRMTIIN能與HO-8910細胞結合，故免疫熒光染色結果與免疫細胞染色結果一致。噬菌體MRMTIIN選擇性與HO-8910細胞結合（圖4a，見插頁），而與PANC-1細胞（圖4b，見插頁）和SKOV3細胞（圖4c，見插頁）均不結合，而對照噬菌體M13K07則均不與這3種細胞結合（圖4d-f，見插頁）。

2.4.4 競爭抑制實驗 隨著合成多肽濃度逐漸增加，噬菌體數(shù)量逐漸減少；而含有相同氨基酸但排列順序不同的對照肽RMTIINM，隨著濃度逐漸增加，噬菌體數(shù)量未見明顯改變，說明多肽MRMTIIN能有效抑制噬菌體MRMTIIN與卵巢癌細胞株HO-8910的結合，見圖5-6。

圖5 合成多肽對噬菌體MRMTIIN與細胞HO-8910結合的抑制作用

3 討論

圖6 合成多肽對噬菌體MRMTIIN與細胞HO-8910結合的抑制作用

噬菌體展示技術[5]是以改造的噬菌體為載體，將外源多肽或蛋白質(zhì)的基因插入噬菌體的基因組中，插入的外源基因并不影響噬菌體自身結構及功能，隨著子代噬菌體的重新組裝，插入的外源多肽繼而以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面；將改造的噬菌體與靶分子共同孵育一段時間，通過離心等方法洗去未結合及親和性較弱的噬菌體，然后讓親和性較高的噬菌體從靶分子中洗脫下來進行擴增，經(jīng)過3～5輪的“吸附-洗脫-擴增”，陽性噬菌體就能得到高度富集；通過基因序列測定分析，進而推導出相應多肽的結構和功能，因此，預先不需要知道目標分子的結構信息。目前各項實驗技術中能實現(xiàn)基因型和表型統(tǒng)一的就只有噬菌體展示技術[6]。經(jīng)過20多年的發(fā)展，噬菌體展示技術已被廣泛應用于單克隆抗體制備、腫瘤抗原篩選、生物疫苗、藥物研制等[7-8]方面。

利用噬菌體展示技術能夠快速、準確地發(fā)現(xiàn)與腫瘤細胞表面特異性結合的小分子多肽[9]。國內(nèi)外利用噬菌體展示技術在體外已成功篩選出各種抗腫瘤短肽，如膀胱癌[10]、肺癌[11]結腸癌細胞[12]、乳腺癌細胞[13]等，這些小分子多肽可能在腫瘤的早期診斷、腫瘤轉移侵襲、腫瘤靶向治療等方面有潛在的臨床應用價值。而目前國內(nèi)外針對抗卵巢癌短肽的研究只有少數(shù)報道。王世宣等[14]利用噬菌體隨機十二肽庫，對卵巢癌細胞株A2780進行4輪生物淘洗，獲得抗腫瘤短肽YYGLAEVDAGGS。Zhang等[15]利用噬菌體隨機十二肽庫，對卵巢癌細胞SKOV3進行3輪生物淘洗，從而獲得卵巢癌細胞表面特異性結合肽SVSVGMKPSPRP，推測能成為卵巢癌靶向治療的配體肽段。

本研究以上皮性卵巢癌細胞株HO-8910為靶細胞，利用噬菌體展示技術，經(jīng)過3輪生物淘洗，回收率從1.5×10-6增加至4.6×10-4，第3輪的回收率與第1輪相比增加了306倍，提示陽性噬菌體得到有效的富集。在ELISA試驗中，選取P/N值高的17個噬菌體單克隆進行DNA測序，根據(jù)插入外源基因序列推導出相應的氨基酸序列，結果顯示這17個噬菌體單克隆中含有9種不同噬菌體，其中展示Met-Arg-Met-Thr-Ile-Ile-Asn（MRMTIIN）序列的噬菌體有7個，出現(xiàn)頻率最高。

為進一步鑒定篩選獲得的噬菌體MRMTIIN與細胞株HO-8910結合的特異性，本研究隨后進行噬菌體結合實驗、免疫細胞染色、免疫熒光染色、競爭抑制實驗。在噬菌體結合實驗中，與PANC-1、SKOV3細胞株相比，噬菌體MRMTIIN與HO-8910細胞有較高的親和力和特異性。免疫細胞染色和免疫熒光染色實驗結果提示，HO-8910細胞表面可見棕黃色顆粒（綠色熒光信號），說明噬菌體MRMTIIN能與HO-8910細胞結合，而PANC-1、SKOV3細胞表面未見棕黃色顆粒（綠色熒光信號），說明噬菌體MRMTIIN不能與PANC-1細胞及SKOV3細胞結合，免疫細胞染色和免疫熒光結果相一致。競爭抑制實驗結果提示，隨著合成多肽濃度逐漸增加，噬菌體數(shù)量逐漸減少，而含有相同氨基酸但排列順序不同的對照肽RMTIINM，隨著濃度逐漸增加，噬菌體數(shù)量未見明顯改變，說明合成多肽MRMTIIN能有效抑制噬菌體MRMTIIN與卵巢癌細胞株HO-8910的結合。

綜上所述，利用噬菌體展示技術篩選出的卵巢癌細胞表面特異性結合肽MRMTIIN能選擇性與HO-8910細胞結合，利用此多肽進行生物體內(nèi)淘洗等實驗，可能會成為上皮性卵巢癌早期診斷的檢測指標。