王翔宇，孫克勤，王毅，劉佳佳，史曉彤

[1.山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院（口腔醫(yī)院），山西 太原 030001；2.山西省太原市第二人民醫(yī)院 口腔科，山西 太原 030002]

牙周病是成人缺牙失牙的重要原因之一[1]，病因復(fù)雜，其始動(dòng)因子是牙菌斑，除此之外一些全身因素等對(duì)牙周病的發(fā)展也有一定的影響。人體當(dāng)中存在的雌激素有雌三醇（E3）、雌二醇（E2）和雌酮（E1），其中E2活性最強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)[2]，雌激素上調(diào)骨保護(hù)因子的表達(dá)并下調(diào)牙周膜干細(xì)胞骨向分化時(shí)核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL）的表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞的功能。雌激素通過(guò)受體作用于靶器官[3]，VITTEK等[4]首次發(fā)現(xiàn)人的牙齦組織也存在雌激素受體（estrogen receptor,ER），證明牙周組織是雌激素重要的靶器官。牙周炎的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中雌激素水平低下起到重要作用[5]。研究表明[6]，正常女性唾液中雌激素的水平較女性牙周炎患者高，低雌激素水平患者服用含高濃度E2的固齒丸后，牙周炎癥狀明顯減輕。目前，針對(duì)雌激素對(duì)牙周炎細(xì)胞的影響這一方面的研究尚未深入。

本研究在復(fù)制去勢(shì)大鼠牙周炎模型的基礎(chǔ)上，探討牙周炎發(fā)展過(guò)程中臨床表現(xiàn)和組織病理學(xué)的改變，為探索牙周病的發(fā)病機(jī)制提供新的資料，進(jìn)而為尋找有效的防治牙周病的方法提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雌性SD大鼠（山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供），17β-E2（美國(guó)Sigma公司），大鼠ER檢測(cè)試劑盒（山東省成武縣醫(yī)用制品廠），電熱恒溫干燥箱（天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（Well wash 4MK2，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械公司），微量電動(dòng)組織勻漿器（0.1～50.0 m，美國(guó)KIMBLE公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及動(dòng)物模型的復(fù)制 ①動(dòng)物分組：雌性SD大鼠33只，3個(gè)月齡，體重220～240 g，并隨機(jī)分為去勢(shì)組（OVX組）、假手術(shù)組（Sham組）和去勢(shì)加雌激素組（OVX+E組），每組11只，常規(guī)飼養(yǎng)。②復(fù)制雌鼠慢性牙周炎模型：雌鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，OVX組和OVX+E組行卵巢摘除術(shù)，Sham組僅做打開、關(guān)閉腹腔手術(shù)，并不切除雙側(cè)卵巢。去勢(shì)手術(shù)及假手術(shù)后第2天起，OVX+E組雌性大鼠腹腔皮下注射17β-E2；其余兩組大鼠在同一時(shí)間腹腔皮下注射同等體積的生理鹽水。3組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)，正常飲水。在術(shù)后第3周，對(duì)3組大鼠右側(cè)上頜第一磨牙進(jìn)行牙周結(jié)扎術(shù)，對(duì)側(cè)牙齒不作處理，作為同體對(duì)照側(cè)。自醒，用普通飼料喂養(yǎng)大鼠。③大鼠內(nèi)眥靜脈血的采取與測(cè)定：大鼠牙周結(jié)扎手術(shù)后第2、4、6周分別取各組大鼠內(nèi)眥靜脈血約4 ml，收集血液對(duì)血清離心并檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 觀察指標(biāo)及方法 ①血清E2水平：在大鼠進(jìn)行牙周結(jié)扎手術(shù)前以及雙側(cè)卵巢去除術(shù)后第2、4、6周分別抽取3組大鼠內(nèi)眥靜脈血，測(cè)量其血清E2水平。②臨床觀察：在牙周手術(shù)后第2、4、6周檢查各組大鼠口腔牙周組織的狀況，并對(duì)3組大鼠牙周炎進(jìn)程進(jìn)行比較。③組織學(xué)觀察：3組大鼠在牙周結(jié)扎手術(shù)后2、4、6周每組隨機(jī)抽取4只大鼠斷頭處死，取大鼠兩側(cè)上頜第一磨牙及其牙周組織的上頜骨標(biāo)本。脫鈣后脫水，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠牙周組織的變化情況。

1.2.3 牙周得分標(biāo)準(zhǔn) 0分：牙齦健康，無(wú)炎癥及出血，無(wú)牙周袋；1分：牙齦顏色有炎癥改變，輕度水腫充血，點(diǎn)彩不明顯，探診少量出血；2分：牙齦質(zhì)地松軟，齦乳頭圓鈍腫脹，齦溝加深且探診有出血；3分：牙齦質(zhì)地變軟且邊緣圓鈍，顏色發(fā)紅，探診出血，牙周探針可探0.6 mm左右的淺牙周袋；4分：齦乳頭水腫糜爛，牙齦發(fā)紅，探診后有出血，牙周探針可探0.8 mm左右的牙周袋；5分：腭側(cè)齦緣黏膜糜爛壞死，牙齦深紅色，探診后出血嚴(yán)重，可探及1.0 mm左右的牙周袋；6分：牙齦萎縮，齦乳頭糜爛，暴露出牙根，牙齒Ⅱ度松動(dòng)，可探及＞1.5 mm的牙周袋且牙周袋溢膿。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，比較用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠血清E2水平的比較

3組大鼠牙周結(jié)扎手術(shù)前，與牙周結(jié)扎手術(shù)后第2、4、6周的血清E2水平比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果顯示：①3組間的E2水平有差異（F=26.799，P=0.000）；②不同時(shí)間點(diǎn)的E2水平有差異（F=336.238，P=0.000）；③3組的E2水平變化趨勢(shì)有差異（F=222.038，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較E2水平，OVX組與Sham組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），OVX組與OVX+E組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003），Sham組與OVX+E組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.263）。見(jiàn)表1。

在牙周手術(shù)后2、4、6周，OVX+E組和Sham組的血清E2水平基本保持不變，且兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），OVX組血清E2水平逐漸降低，且OVX組血清E2水平均低于其余兩組（P=0.001和0.003）。見(jiàn)圖1。

表1 3組大鼠血清E2水平比較 （n=11，pg/ml）

圖1 3組大鼠血清E2水平在不同時(shí)間的變化趨勢(shì)

2.2 3組大鼠牙周結(jié)扎術(shù)后2、4、6周的臨床表現(xiàn)

3組大鼠均出現(xiàn)不同程度的牙齦炎和牙周炎的臨床表現(xiàn)，病變程度隨時(shí)間變化加重，OVX組較其余兩組嚴(yán)重。OVX組的E2水平較其余兩組低，Sham組和OVX+E組E2水平無(wú)明顯差異。牙周結(jié)扎術(shù)后2、4、6周3組大鼠的臨床表現(xiàn)得分情況見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠的臨床表現(xiàn)得分情況 （n=11，分）

2.3 3組大鼠組織學(xué)情況比較

牙周結(jié)扎手術(shù)2、4、6周后對(duì)各雌鼠標(biāo)本HE染色，光鏡下觀察病理表現(xiàn)：牙周結(jié)扎術(shù)2周后，Sham組大鼠結(jié)合上皮中出現(xiàn)炎癥細(xì)胞，牙齦纖維結(jié)締組織有少量增生（見(jiàn)圖2A）；OVX組大鼠牙齦纖維組織水腫明顯，結(jié)締組織中有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)合上皮釘突增生且有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，牙周膜排列整齊（見(jiàn)圖2B）；OVX+E組大鼠纖維結(jié)締組織水腫，且毛細(xì)血管增生擴(kuò)張（見(jiàn)圖2C）。牙周結(jié)扎術(shù)4周后，Sham組大鼠纖維結(jié)締組織水腫增生，牙齦結(jié)合上皮釘突變性而且明顯增生（見(jiàn)圖3A）；OVX組大鼠形成了牙周袋，牙周袋壁有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維結(jié)締組織增生，出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞，牙周膜膠原纖維變性壞死（見(jiàn)圖3B）；OVX+E組大鼠牙周袋壁有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維結(jié)締組織增生水腫（見(jiàn)圖3C）。牙周結(jié)扎術(shù)6周后，Sham組大鼠牙周袋變深，纖維結(jié)締組織增生明顯且內(nèi)有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（見(jiàn)圖4A）；OVX組大鼠結(jié)合上皮中有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮向下遷移形成深的牙周袋，結(jié)締組織內(nèi)的膠原纖維和基質(zhì)被大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)并發(fā)生變性（見(jiàn)圖4B）；OVX+E組大鼠牙周袋加深，袋壁內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，牙周膜內(nèi)的膠原纖維變性并開始出現(xiàn)降解，結(jié)締組織內(nèi)開始出現(xiàn)淋巴細(xì)胞（見(jiàn)圖4C）。

3組大鼠標(biāo)本進(jìn)行HE染色觀察，其嚴(yán)重程度不同，OVX組較其余兩組嚴(yán)重，OVX+E組較Sham組牙周炎程度稍嚴(yán)重。

圖2 3組大鼠牙周結(jié)扎術(shù)后2周病理圖 （HE染色×200）

圖3 3組大鼠牙周結(jié)扎術(shù)后4周病理圖 （HE染色×200）

本實(shí)驗(yàn)中采用的是同一只大鼠左右兩側(cè)相對(duì)照的方法，大鼠左側(cè)上頜第1磨牙沒(méi)有進(jìn)行牙周結(jié)扎手術(shù)，對(duì)照側(cè)的3組大鼠的牙周組織在臨床表現(xiàn)以及病理表現(xiàn)并無(wú)明顯的差異。見(jiàn)圖5。

圖4 3組大鼠牙周結(jié)扎術(shù)后6周病理圖 （HE染色×200）

圖5 牙周結(jié)扎術(shù)后對(duì)照側(cè)病理圖 （HE染色×200）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選用大鼠用于牙周病的實(shí)驗(yàn)研究，成功復(fù)制去勢(shì)大鼠牙周炎的動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件以減少額外變量對(duì)結(jié)果的影響。通過(guò)觀察雌性大鼠右側(cè)上頜第1磨牙牙周組織臨床表現(xiàn)并進(jìn)行HE染色觀察大鼠牙周炎進(jìn)展過(guò)程中組織細(xì)胞學(xué)的變化，研究討論雌性大鼠牙周炎病程發(fā)展中牙周組織發(fā)生的改變。對(duì)3組大鼠在牙周結(jié)扎術(shù)后分別進(jìn)行臨床觀察，在術(shù)后第2、4、6周觀察到3組大鼠結(jié)扎側(cè)（右側(cè)）都表現(xiàn)出了不同程度的牙周炎的癥狀，而且隨著時(shí)間的推移，發(fā)現(xiàn)OVX組大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中臨床表現(xiàn)展現(xiàn)出牙周病從發(fā)生到發(fā)展一個(gè)連續(xù)的病理過(guò)程。結(jié)扎術(shù)后2周大鼠表現(xiàn)出牙齦炎早期的臨床表現(xiàn)，此時(shí)牙槽骨和牙周膜的結(jié)構(gòu)并沒(méi)有破壞，僅僅表現(xiàn)為牙齦紅腫，結(jié)締組織內(nèi)有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；結(jié)扎術(shù)后4周大鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的牙周組織炎癥反應(yīng)，牙周膜膠原纖維結(jié)構(gòu)被破壞，牙齦紅腫糜爛，潰瘍形成，結(jié)締組織內(nèi)開始有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，牙槽骨開始有吸收；結(jié)扎術(shù)后6周大鼠表現(xiàn)出重度牙周病的臨床癥狀，結(jié)合上皮中有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，牙周袋形成，牙槽骨明顯吸收。OVX組牙周炎病變程度較其余兩組嚴(yán)重，提示大鼠牙周炎的病變程度加重可能是由于血清雌激素水平的降低導(dǎo)致的。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格控制非實(shí)驗(yàn)變量的其他額外因素，說(shuō)明OVX組血清雌激素的低水平致使其牙周病臨床癥狀加重。雌激素對(duì)女性而言是一種非常重要的激素，可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的數(shù)量從而促進(jìn)骨形成或者骨吸收，血清雌激素低下會(huì)破壞骨吸收與骨形成之間的平衡，導(dǎo)致絕經(jīng)期婦女容易患骨質(zhì)疏松癥[7]。在去勢(shì)動(dòng)物模型研究中發(fā)現(xiàn)，其牙周干細(xì)胞增殖分化能力降低，導(dǎo)致其頜骨骨密度下降，引起牙周炎的發(fā)生[8-9]。本研究中，雖然Sham組和OVX+E組的大鼠表現(xiàn)出一些牙周炎的臨床癥狀，但是OVX組在3個(gè)時(shí)間段牙周炎的臨床癥狀比OVX+E組嚴(yán)重，而Sham組臨床牙周炎的癥狀比OVX+E組的癥狀輕微。這表明血清雌激素水平降低會(huì)促進(jìn)牙周炎的發(fā)展，加重牙周炎的癥狀，促進(jìn)牙周組織的破壞，雌激素替代療法對(duì)治療絕經(jīng)后婦女的牙周病有一定療效[10-11]，補(bǔ)充雌激素之后，牙周組織附著喪失量明顯減少[12]。