王翔宇，孫克勤，王毅，劉佳佳，史曉彤

[1.山西醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院（口腔醫(yī)院），山西 太原 030001；2.山西省太原市第二人民醫(yī)院 口腔科，山西 太原 030002]

牙周病是成人缺牙失牙的重要原因之一[1]，病因復雜，其始動因子是牙菌斑，除此之外一些全身因素等對牙周病的發(fā)展也有一定的影響。人體當中存在的雌激素有雌三醇（E3）、雌二醇（E2）和雌酮（E1），其中E2活性最強。研究發(fā)現(xiàn)[2]，雌激素上調(diào)骨保護因子的表達并下調(diào)牙周膜干細胞骨向分化時核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL）的表達，抑制破骨細胞的功能。雌激素通過受體作用于靶器官[3]，VITTEK等[4]首次發(fā)現(xiàn)人的牙齦組織也存在雌激素受體（estrogen receptor,ER），證明牙周組織是雌激素重要的靶器官。牙周炎的發(fā)生、發(fā)展過程中雌激素水平低下起到重要作用[5]。研究表明[6]，正常女性唾液中雌激素的水平較女性牙周炎患者高，低雌激素水平患者服用含高濃度E2的固齒丸后，牙周炎癥狀明顯減輕。目前，針對雌激素對牙周炎細胞的影響這一方面的研究尚未深入。

本研究在復制去勢大鼠牙周炎模型的基礎(chǔ)上，探討牙周炎發(fā)展過程中臨床表現(xiàn)和組織病理學的改變，為探索牙周病的發(fā)病機制提供新的資料，進而為尋找有效的防治牙周病的方法提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

雌性SD大鼠（山西醫(yī)科大學動物中心提供），17β-E2（美國Sigma公司），大鼠ER檢測試劑盒（山東省成武縣醫(yī)用制品廠），電熱恒溫干燥箱（天津市華北實驗儀器有限公司），隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（Well wash 4MK2，上海躍進醫(yī)療器械公司），微量電動組織勻漿器（0.1～50.0 m，美國KIMBLE公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及動物模型的復制 ①動物分組：雌性SD大鼠33只，3個月齡，體重220～240 g，并隨機分為去勢組（OVX組）、假手術(shù)組（Sham組）和去勢加雌激素組（OVX+E組），每組11只，常規(guī)飼養(yǎng)。②復制雌鼠慢性牙周炎模型：雌鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，OVX組和OVX+E組行卵巢摘除術(shù)，Sham組僅做打開、關(guān)閉腹腔手術(shù)，并不切除雙側(cè)卵巢。去勢手術(shù)及假手術(shù)后第2天起，OVX+E組雌性大鼠腹腔皮下注射17β-E2；其余兩組大鼠在同一時間腹腔皮下注射同等體積的生理鹽水。3組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)，正常飲水。在術(shù)后第3周，對3組大鼠右側(cè)上頜第一磨牙進行牙周結(jié)扎術(shù)，對側(cè)牙齒不作處理，作為同體對照側(cè)。自醒，用普通飼料喂養(yǎng)大鼠。③大鼠內(nèi)眥靜脈血的采取與測定：大鼠牙周結(jié)扎手術(shù)后第2、4、6周分別取各組大鼠內(nèi)眥靜脈血約4 ml，收集血液對血清離心并檢測，對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

1.2.2 觀察指標及方法 ①血清E2水平：在大鼠進行牙周結(jié)扎手術(shù)前以及雙側(cè)卵巢去除術(shù)后第2、4、6周分別抽取3組大鼠內(nèi)眥靜脈血，測量其血清E2水平。②臨床觀察：在牙周手術(shù)后第2、4、6周檢查各組大鼠口腔牙周組織的狀況，并對3組大鼠牙周炎進程進行比較。③組織學觀察：3組大鼠在牙周結(jié)扎手術(shù)后2、4、6周每組隨機抽取4只大鼠斷頭處死，取大鼠兩側(cè)上頜第一磨牙及其牙周組織的上頜骨標本。脫鈣后脫水，HE染色，光學顯微鏡下觀察各組大鼠牙周組織的變化情況。

1.2.3 牙周得分標準 0分：牙齦健康，無炎癥及出血，無牙周袋；1分：牙齦顏色有炎癥改變，輕度水腫充血，點彩不明顯，探診少量出血；2分：牙齦質(zhì)地松軟，齦乳頭圓鈍腫脹，齦溝加深且探診有出血；3分：牙齦質(zhì)地變軟且邊緣圓鈍，顏色發(fā)紅，探診出血，牙周探針可探0.6 mm左右的淺牙周袋；4分：齦乳頭水腫糜爛，牙齦發(fā)紅，探診后有出血，牙周探針可探0.8 mm左右的牙周袋；5分：腭側(cè)齦緣黏膜糜爛壞死，牙齦深紅色，探診后出血嚴重，可探及1.0 mm左右的牙周袋；6分：牙齦萎縮，齦乳頭糜爛，暴露出牙根，牙齒Ⅱ度松動，可探及＞1.5 mm的牙周袋且牙周袋溢膿。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）描述，比較用重復測量設(shè)計的方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠血清E2水平的比較

3組大鼠牙周結(jié)扎手術(shù)前，與牙周結(jié)扎手術(shù)后第2、4、6周的血清E2水平比較，采用重復測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果顯示：①3組間的E2水平有差異（F=26.799，P=0.000）；②不同時間點的E2水平有差異（F=336.238，P=0.000）；③3組的E2水平變化趨勢有差異（F=222.038，P=0.000）。進一步兩兩比較E2水平，OVX組與Sham組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001），OVX組與OVX+E組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.003），Sham組與OVX+E組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.263）。見表1。

在牙周手術(shù)后2、4、6周，OVX+E組和Sham組的血清E2水平基本保持不變，且兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），OVX組血清E2水平逐漸降低，且OVX組血清E2水平均低于其余兩組（P=0.001和0.003）。見圖1。

表1 3組大鼠血清E2水平比較 （n=11，pg/ml）

圖1 3組大鼠血清E2水平在不同時間的變化趨勢

2.2 3組大鼠牙周結(jié)扎術(shù)后2、4、6周的臨床表現(xiàn)

3組大鼠均出現(xiàn)不同程度的牙齦炎和牙周炎的臨床表現(xiàn)，病變程度隨時間變化加重，OVX組較其余兩組嚴重。OVX組的E2水平較其余兩組低，Sham組和OVX+E組E2水平無明顯差異。牙周結(jié)扎術(shù)后2、4、6周3組大鼠的臨床表現(xiàn)得分情況見表2。

表2 3組大鼠的臨床表現(xiàn)得分情況 （n=11，分）

2.3 3組大鼠組織學情況比較

牙周結(jié)扎手術(shù)2、4、6周后對各雌鼠標本HE染色，光鏡下觀察病理表現(xiàn)：牙周結(jié)扎術(shù)2周后，Sham組大鼠結(jié)合上皮中出現(xiàn)炎癥細胞，牙齦纖維結(jié)締組織有少量增生（見圖2A）；OVX組大鼠牙齦纖維組織水腫明顯，結(jié)締組織中有大量中性粒細胞浸潤，結(jié)合上皮釘突增生且有大量中性粒細胞浸潤，牙周膜排列整齊（見圖2B）；OVX+E組大鼠纖維結(jié)締組織水腫，且毛細血管增生擴張（見圖2C）。牙周結(jié)扎術(shù)4周后，Sham組大鼠纖維結(jié)締組織水腫增生，牙齦結(jié)合上皮釘突變性而且明顯增生（見圖3A）；OVX組大鼠形成了牙周袋，牙周袋壁有大量炎癥細胞浸潤，纖維結(jié)締組織增生，出現(xiàn)大量淋巴細胞，牙周膜膠原纖維變性壞死（見圖3B）；OVX+E組大鼠牙周袋壁有大量的炎癥細胞浸潤，纖維結(jié)締組織增生水腫（見圖3C）。牙周結(jié)扎術(shù)6周后，Sham組大鼠牙周袋變深，纖維結(jié)締組織增生明顯且內(nèi)有大量中性粒細胞浸潤（見圖4A）；OVX組大鼠結(jié)合上皮中有大量中性粒細胞浸潤，上皮向下遷移形成深的牙周袋，結(jié)締組織內(nèi)的膠原纖維和基質(zhì)被大量炎癥細胞浸潤并發(fā)生變性（見圖4B）；OVX+E組大鼠牙周袋加深，袋壁內(nèi)有大量炎癥細胞浸潤，牙周膜內(nèi)的膠原纖維變性并開始出現(xiàn)降解，結(jié)締組織內(nèi)開始出現(xiàn)淋巴細胞（見圖4C）。

3組大鼠標本進行HE染色觀察，其嚴重程度不同，OVX組較其余兩組嚴重，OVX+E組較Sham組牙周炎程度稍嚴重。

圖2 3組大鼠牙周結(jié)扎術(shù)后2周病理圖 （HE染色×200）

圖3 3組大鼠牙周結(jié)扎術(shù)后4周病理圖 （HE染色×200）

本實驗中采用的是同一只大鼠左右兩側(cè)相對照的方法，大鼠左側(cè)上頜第1磨牙沒有進行牙周結(jié)扎手術(shù)，對照側(cè)的3組大鼠的牙周組織在臨床表現(xiàn)以及病理表現(xiàn)并無明顯的差異。見圖5。

圖4 3組大鼠牙周結(jié)扎術(shù)后6周病理圖 （HE染色×200）

圖5 牙周結(jié)扎術(shù)后對照側(cè)病理圖 （HE染色×200）

3 討論

本實驗選用大鼠用于牙周病的實驗研究，成功復制去勢大鼠牙周炎的動物模型。本實驗嚴格控制實驗條件以減少額外變量對結(jié)果的影響。通過觀察雌性大鼠右側(cè)上頜第1磨牙牙周組織臨床表現(xiàn)并進行HE染色觀察大鼠牙周炎進展過程中組織細胞學的變化，研究討論雌性大鼠牙周炎病程發(fā)展中牙周組織發(fā)生的改變。對3組大鼠在牙周結(jié)扎術(shù)后分別進行臨床觀察，在術(shù)后第2、4、6周觀察到3組大鼠結(jié)扎側(cè)（右側(cè)）都表現(xiàn)出了不同程度的牙周炎的癥狀，而且隨著時間的推移，發(fā)現(xiàn)OVX組大鼠在實驗過程中臨床表現(xiàn)展現(xiàn)出牙周病從發(fā)生到發(fā)展一個連續(xù)的病理過程。結(jié)扎術(shù)后2周大鼠表現(xiàn)出牙齦炎早期的臨床表現(xiàn)，此時牙槽骨和牙周膜的結(jié)構(gòu)并沒有破壞，僅僅表現(xiàn)為牙齦紅腫，結(jié)締組織內(nèi)有大量中性粒細胞浸潤；結(jié)扎術(shù)后4周大鼠表現(xiàn)出嚴重的牙周組織炎癥反應(yīng)，牙周膜膠原纖維結(jié)構(gòu)被破壞，牙齦紅腫糜爛，潰瘍形成，結(jié)締組織內(nèi)開始有淋巴細胞浸潤，牙槽骨開始有吸收；結(jié)扎術(shù)后6周大鼠表現(xiàn)出重度牙周病的臨床癥狀，結(jié)合上皮中有大量中性粒細胞浸潤，牙周袋形成，牙槽骨明顯吸收。OVX組牙周炎病變程度較其余兩組嚴重，提示大鼠牙周炎的病變程度加重可能是由于血清雌激素水平的降低導致的。本實驗嚴格控制非實驗變量的其他額外因素，說明OVX組血清雌激素的低水平致使其牙周病臨床癥狀加重。雌激素對女性而言是一種非常重要的激素，可以調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞的數(shù)量從而促進骨形成或者骨吸收，血清雌激素低下會破壞骨吸收與骨形成之間的平衡，導致絕經(jīng)期婦女容易患骨質(zhì)疏松癥[7]。在去勢動物模型研究中發(fā)現(xiàn)，其牙周干細胞增殖分化能力降低，導致其頜骨骨密度下降，引起牙周炎的發(fā)生[8-9]。本研究中，雖然Sham組和OVX+E組的大鼠表現(xiàn)出一些牙周炎的臨床癥狀，但是OVX組在3個時間段牙周炎的臨床癥狀比OVX+E組嚴重，而Sham組臨床牙周炎的癥狀比OVX+E組的癥狀輕微。這表明血清雌激素水平降低會促進牙周炎的發(fā)展，加重牙周炎的癥狀，促進牙周組織的破壞，雌激素替代療法對治療絕經(jīng)后婦女的牙周病有一定療效[10-11]，補充雌激素之后，牙周組織附著喪失量明顯減少[12]。